专利名称：Gdsl蛋白在制备脂肪酶中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及⑶SL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。
背景技术：
脂肪酶(lipase,triacylglycerolacylhydrolases,EC3. I. I. 3)即三酸基甘油酰基水解酶，是工业酶制剂中最重要的酶类之一，能够在油水界面催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，同时还能催化酯交换、转酯、酯合成、醇解、酸解、氨解等多种化学反应，通常具有催化效率高、催化条件简单的优点。目前工业上应用的脂肪酶大多为微生物产生的胞外酶，从反应温度来说多为中温酶(最适反应温度37-40°C )，在高温下反应受到限制。嗜热酶是指最佳催化温度60-85°C的酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高、作用温度广泛(在高温下的稳定性也 较好)、作用PH广泛等，因而能克服中温酶(20-55°C )及低温酶(2-20°C )在应用过程中出现的生物学性质不稳定的现象，可以取代传统的中温酶催化及化学催化，为优化工艺流程开辟了一条新途径。利用热稳定性好的脂肪酶作为生物催化剂具有如下优点⑴由于该脂肪酶的稳定性高，可在室温下分离提纯和包装运输、并能长久保持活性，从而制备脂肪酶的成本降低；(2)对反应器冷却系统的要求标准低，从而减少了能量消耗，且由于其耐高温特性，在生产中不需要复杂的冷却装置，既节省了开支又降低了冷却过程对环境造成的污染；(3)随反应温度的提高，酶分子运动速度加快，催化能力加强，加快了动力学反应，从而使用效率得到了提高；(4)由于采用高温反应条件，降低了中温微生物污染反应体系的危险，从而提高了产物纯度，同时高温反应条件还提高了有机化合物的生物可利用性和可溶性，从而实现了有效的生物修复。脂肪酶的热稳定性问题一直是脂肪酶研究及生产和应用的瓶颈问题，就目前脂肪酶的研究现状来看，仅通过蛋白质工程来改善脂肪酶特性，远不能解决各个领域对脂肪酶的要求。因此，寻找发现具有新特性、耐热、高活力、符合现代生物工程要求的脂肪酶是一项非常有意义的工作。
发明内容
本发明的目的是提供GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。本发明提供了⑶SL蛋白的应用，为如下(I)或(2)(I)制备脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。应用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物时，所述降解的反应条件为30-80 V、pH6. 5-8. O，所述降解的反应条件优选为65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。本发明还保护将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将所述⑶SL蛋白的编码基因插入载体pET-28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒。所述⑶SL蛋白的编码基因具体可为如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白的 DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明还保护一种制备⑶SL蛋白的方法，是培养以上所述的重组菌，得到所述⑶SL蛋白。所述方法中，所述培养的具体步骤为将重组菌接种至LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)，振荡培养至0D_达到O. 8，然后加入IPTG (诱导剂)至浓度为Immo/L，20°C、200rpm振荡培养12小时。所述方法中，在培养重组菌后还包括超声破碎和将超声破碎的上清进行亲和层析的步骤。所述超声破碎的具体参数为功率300W、总工作时间90min,每工作5s间歇8s), 12000rpm离心IOmin,收集上清液。所述亲和层析具体可为镍柱亲和层析。本发明还保护一种降解脂肪酶的底物的方法，是采用所述GDSL蛋白降解脂肪酶的底物。所述降解的反应条件为30-80°C、pH6. 5-8. O。所述降解的反应条件优选为65°C、pH7. 5。所述脂肪酶的底物具体可为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。本发明发现所述GDSL蛋白具有脂肪酶活性，将所述GDSL蛋白用作脂肪酶，具有如下优点可以采用较高的反应温度；具有良好的热稳定性；可以在碱性条件下作用；具有良好的PH稳定性；对02-(12的底物均可发挥作用；酶活力较高。本发明为涉及脂肪酶的工艺流程开辟了一条新途径，具有重大的经济价值。
图I为实施例I中60°C培养条件下复筛获得脂肪酶菌株。图2为实施例I中各个菌株的酶活初测结果。图3为⑶SL蛋白的三维结构预测图。图4为重组质粒pET_28a - B2的结构示意图。图5为在大肠杆菌中诱导表达⑶SL蛋白的SDS-PAGE ;1、分子量标记，2、对照菌得到的上清液、3、重组菌得到的上清液。图6为对硝基苯酚一吸光度标准曲线。图7为纯化后蛋白的电泳图。图8为目的蛋白的质谱鉴定结果。
图9为实施例3中的最适pH及pH稳定性测定结果。图10为实施例3中的最适温度及热稳定性测定结果。图11为实施例3中各个试剂对酶活的影响。图12为实施例3中各个有机溶剂对酶活的影响。图13为实施例3中去污剂对酶活的影响。图14为实施例3中蛋白酶对酶活的影响。 图15为实施例4中对不同碳链长度底物特异性。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。载体pET-28a(+) :Novagen，GR201023。大肠杆菌BL21 (DE3):北京全式金生物技术有限公司，CD601-01。对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP) :Sigma，1492-30-4。对硝基苯酚(PNP)Sigma,4043-96-3。CHAPS 的英文全称为 3-[ (3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate )。实施例I、野生菌的获得以及脂肪酶的发现一、产脂肪酶菌株筛选初筛培养基(g/L)=(NH4)2SO4 lg、NH4N03 lg、NaCl lg、MgS04 ·7Η20 0. lg、K2HP03lg、FeSO4 · 7Η20 O. Olg、Na2CO3 调 PH 至 8. O,再加 I. 0% 橄榄油，灭菌。液体发酵培养基(g/L):可溶性淀粉10g、(NH4)2SO4 5g、K2HPO3 lg、玉米浆粉20g、黄豆饼粉20g、三油精10g，pH8. O。初筛池塘底泥样品取自浙江嘉兴欣欣饲料有限公司的混养鱼池塘，取样时间为2009年7月，4°C条件保存样品。将池塘底泥样用无菌PBS缓冲液进行十倍梯度稀释，取100微升涂布于初筛培养基，放于60°C温度下进行培养，产脂肪酶菌株能够降解橄榄油产生透明圈，依据产生透明圈直径和菌落直径比值大的甄别其脂肪酶活性强弱。复筛将分离纯化的具有脂肪酶活性的菌株接种入复筛固体(复测产真脂肪酶菌株)或液体发酵培养基(诱导产酶测活性)，固体平板放入30或60°C温度下进行培养，观察降解透明菌。通过高温筛选策略和罗丹明橄榄油筛选方法初步获得26株耐高温脂肪酶产生菌，再通过三油精复筛策略获得12株菌显示出较大透明圈。60°C培养条件下复筛获得脂肪酶菌株见图I。其中B2、B6、B9、B12为高温培养条件筛选到的脂肪酶菌。采用液体发酵培养基在200r/min，60°C摇床培养48h。将菌体12，OOOrpm离心2min，取上清，将菌体重悬于50mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)缓冲液中，用超声波破碎仪破碎细胞(4s/次，间隔10s，破碎30次)，13，000rpm，4°C离心lOmin，即得菌体胞内酶上清。将上清进行酶活初测。通过对胞外及胞内酶活测定发现筛选获得的细菌菌株胞外检测到的酶活均高于胞内酶活。酶活初测结果见图2。取酶活最高的B2菌株进行后续试验。二、菌株的鉴定提取B2菌株基因组DNA，并采用16S rDNA通用引物27F和1492R进行16S rDNA的 PCR 扩增。27F :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R :5’ -TACCTTGTTACGACTT-3，。反应体系10X PCR buffer 5 μ L, dNTP mix (2. 5mmol/L) 4 μ L、Taq (5U/μ L)0. 5 μ L、27F(25 μ mol/L) I μ L、1492R(25 μ mol/L) I μ L、模板 DNA I μ L、ddH20 8 μ L、总体积50 μ L0PCR 反应条件95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin30s，32 个循环后；72°C延伸 IOmin0测序所得16S rDNA基因序列长度大约1500bp，如序列表的序列I所示。将菌株的16S rDNA基因序列在GenBank核酸数据库进行比对与Geobacillus toebii (EU391540)具有较高相似性，初步判断其属于Geobacillus sp.。三、脂肪酶的发现
从B2菌株中发现一个蛋白，具有脂肪酶的功能，将其命名为GDSL蛋白，如序列表的序列2所示。将编码GDSL蛋白的基因命名为GDSL基因，其开放阅读框如序列表的序列
3所示。⑶SL蛋白的三维结构预测图见图3。实施例2、⑶SL蛋白的制备一、重组表达载体的构建I、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用B2F和B2R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。B2F: 5 ’ -GACGAATTCATGAGACGCGGTATTGTAAGCAC-3’ (下滑线标注限制性内切酶EcoRI的酶切识别序列);B2R: 5 ’ -GACGCGGCCGCTTGTTTGTCCTCCTCCGTCCAC-3’ (下划线标注限制性内切酶NotI的酶切识别序列)。PCR 反应条件95°C预变性 5min ；94°C 30sec、60°C 30sec、72°C lmin, 30 个循环；最后72°C延伸lOmin。3、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切载体pET_28a(+)，回收载体骨架(约5300bp)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET_28a - B2。根据测序结果，对重组质粒pET-28a - B2进行结构描述如下在载体pET_28a(+)的EcoRI和NotI酶切位点之间插入了序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的双链DNA分子(插入的双链DNA分子的3’末端与载体上的His标签编码基因融合，以便于进行后续的蛋白纯化)。重组质粒pET-28a - B2的结构示意图见图4。二、重组菌的构建将重组质粒pET_28a - B2导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到重组菌。将载体pET_28a(+)导入大肠杆菌BL21 (DE3)，得到对照菌。三、⑶SL蛋白的表达和鉴定I、将重组菌或对照菌接种至5mL LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振荡培养过夜。2、将步骤I的菌液以1/100的体积比接种至20mL LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振荡培养至OD6tltl达到O. 6 ;然后加入IPTG (诱导剂)至浓度为lmmo/L，20°C、200rpm 振荡培养 12 小时。3、取步骤2得到的菌液离心并收集菌体，然后将菌体进行超声破碎(功率300W、总工作时间90min,每工作5s间歇8s), 12000rpm离心lOmin,收集上清液。4、将重组菌步骤3得到的上清液和对照菌步骤3得到的上清液进行SDS-PAGE，结果见图5。重组菌得到的上清液中具有分子量约为29. 5kD的预期蛋白条带，而对照菌得到的上清液不显示该蛋白条带。将目的蛋白从SDS-PAGE上切下来，送天津生物芯片技有有限公司进行一级质谱鉴定。结果表明，该蛋白确实为序列表的序列2所示的GDSL蛋白。5、将重组菌步骤3得到的上清液和对照菌步骤3得到的上清液分别作为待测溶液进行脂肪酶酶活检测。
采用对硝基苯酚制作标准曲线，见图6。标准曲线方程为y=57. 548x-0. 9233，R2=O. 9993，y代表酶活(单位为μ mol/min), x代表采用分光光度计测定得到的405nm光吸收值。通过脂肪酶将对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPP)降解为黄色的对硝基苯酚(PNP)原理，采用分光光度法检测待测溶液(或其稀释液)的脂肪酶活性。具体操作过程如下将试管中按顺序加入I. 8mL溶液B和O. ImL溶液A，37°C水浴保温5min ;将试管分为对照管和样品管，对照管中加入已高温煮沸灭活的待测溶液(或其稀释液)0. ImL并混匀，样品管中加入待测溶液(或其稀释液)O. ImL并混匀，立即计时，37°C反应IOmin后每个试管加入ImL 95%乙醇水溶液以终止反应；采用分光光度计测定405nm光吸收值。溶液A :称取90mg对硝基苯酚棕榈酸酯溶于30mL异丙醇。溶液B 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8. O)。I个酶活单位脂肪酶的定义在pH8. 0、37°C条件下，每分钟释放I μ mo I对硝基酚所需要的酶量。酶活计算公式A=([At-A0] XK+C0) XVlXn/(V2Xt)A 一待测溶液的酶活(U/mL)，At 一反应后样品管的光吸收值，A0 一反应后对照管的光吸收值，K=57. 4，Co=O. 9233，η 一稀释倍数，Vl 一反应液的体积(2mL)，V2 一加入试管的待测溶液(或其稀释液)的体积(O. ImL), t 一反应时间(lOmin)。重组菌步骤3得到的上清液的酶活为4. 48U/mL,对照菌步骤3得到上清液的酶活为 OU/mL。四、⑶SL蛋白的表达和纯化I、将重组菌接种至50mL LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振荡培养过夜。2、将4mL步骤I的菌液接种至200mL LB液体培养基(含100 μ g/mL卡那霉素)，37°C、200rpm振荡培养至OD6tltl达到0. 8 ;然后加入IPTG (诱导剂)至浓度为lmmo/L，20°C、200rpm振荡培养12小时。3、取步骤2得到的菌液离心并收集菌体，然后将菌体进行超声破碎(功率300W、总工作时间90min,每工作5s间歇8s), 12000rpm离心lOmin,收集上清液。4、将步骤3得到的上清液进行亲和层析(镍柱)。采用ImL 的 NTA 柱。洗脱过程中的缓冲液(pH均为 7. 6)如下ΝΤΑ-0 :含 20mmol/L Tris-HCl.O. 5mol/LNaCl 和 10g/100mL 甘油；NTA_60 :含 20mmol/L Tris-HCl、60mmol/L 咪唑、O. 5mol/LNaCl和 lOg/lOOmL 甘油；NTA-200 含 20mmol/L Tris-HCl、200mmol/L 咪唑、0. 5mol/LNaCl 和lOg/lOOmL 甘油。洗脱过程(1)柱子用10_20mL水平衡，每次加5mL待流净后再加，以后皆同；(2)用NTA-O平衡15-20mL，然后上样5mL步骤3得到的上清液；(3)用5mL NTA-60进行洗脱，以去除杂蛋白；(4)用5mL NTA-200洗脱目的蛋白，收集过柱后的溶液，即为⑶SL蛋白液。5、将步骤4得到的⑶SL蛋白液进行SDS-PAGE，结果见图7。结果表明，亲和层析后得到了电泳纯的GDSL蛋白。6、切下步骤5中的目的条带并进行质谱氨基酸测定，结果见图8，结果表明该目的蛋白确实为序列表的序列2所不的GDSL蛋白。实施例3、⑶SL蛋白作为脂肪酶的性质鉴定 采用实施例2的步骤四的4制备的GDSL蛋白液进行实施例3的各个实验。—、最适pH及pH稳定性测定I、最适 pH检测⑶SL蛋白液的最适pH，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用不同的缓冲液作为溶液B，分别采用如下缓冲液pH2. 0-3. 6的50mmol/L Gly-HCl缓冲液、pH3. 6-5. O 的 50mmol/L HAc-NaAc 缓冲液、ρΗ5· 0-8. O 的 50mmol/L 柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液、pH8. 0-9. O 的 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液和 ρΗ9· 0-12. O 的 50mmol/L Gly-NaOH 缓冲液。采用pH7. 5的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液作为溶液B时酶活最高，将该最高酶活作为100%，计算采用其它缓冲液作为溶液B的条件下的相对酶活，部分结果见图9(a)。图9(a)中，PH8. O的点为Tris-HCl缓冲液，ρΗ9· O的点为Gly-NaOH缓冲液。结果表明，⑶SL蛋白作为脂肪酶的最适pH为7. 5，在pH6. 5-8.0范围内酶活性可以维持在60%以上，pH在5以下或9以上时没有酶活检出。2、pH 稳定性预处理将I体积份⑶SL蛋白液与10体积份不同缓冲液混合，37°C处理60min。分别采用如下缓冲液pH3. 0-5. O的50mmol/L HAc-NaAc缓冲液、pH5. 0-8. O的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液、pH8. 0-9. O 的 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液和 pH9. 0-12. O 的 50mmol/L Gly-NaOH 缓冲液。将预处理后的蛋白液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。采用PH12. O的Gly-NaOH缓冲液进行预处理时酶活最高，将该最高酶活作为100%，计算采用其它预处理条件下的相对酶活，部分结果见图9(b)。图9 (a)中，pH5.0的点为柠檬酸-Na2HPO4缓冲液，pH8. O的点为Tris-HCl缓冲液，pH9. O的点为Gly-NaOH O缓冲液。结果表明，⑶SL蛋白在pH 4.0- 12. O范围内较稳定，剩余酶活性能保持70%以上，随着pH值增加该酶越稳定,说明此酶在中性及碱性条件下具有较好的pH稳定性。二、最适温度及热稳定性测定I、最适温度将GDSL蛋白液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用PH7. 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液并且采用不同的反应温度(20_80°C )。
采用65°C进行反应时酶活最高，将该最高酶活作为100%，计算采用其它反应温度下的相对酶活，结果见图10 (a)。结果表明，GDSL蛋白作为脂肪酶的最适反应温度为65°C，并且在30-80°C间具有较高的活性，保持50. 0%以上的活性；OTSL蛋白作为脂肪酶在30-65°C时随着反应温度的增加酶活性亦随之增加，反应温度超过65°C后酶活呈下降趋势，当反应温度80°C，剩余酶活为62. 0%。2、热稳定性预处理，将⑶SL蛋白液在不同温度下处理3小时，并分别于O. 5、I、2、3小时取样，
立即置在冰水上。将预处理后的蛋白液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。
将不进行预处理的酶活作为100%，将该最高酶活作为100%，计算采用各个预处理温度条件下的相对酶活，结果见图10 (b)。结果表明，⑶SL蛋白在60-80°C处理3h后剩余酶活达60%以上，在60°C条件下酶活几乎不受影响高达92%，90V处理后酶活可达47%，表明⑶SL蛋白是高温脂肪酶。三、不同金属离子及相关化学试剂对酶活的影响在反应体系中加入不同试剂(金属离子或化学试剂)，来检测试剂对酶活性的影响，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用PH7. 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。试剂在反应体系中终浓度为ImmoI/L或IOmmoI/L。以不加入试剂的反应体系作为对M(CK)0以CK处理组的酶活作为100%，计算各个处理组的相对酶活，结果见图11。在低浓度(ImM)时，Zn2+和β巯基乙醇对GDSL蛋白的脂肪酶酶活有激活作用，而其它金属离子的影响不明显。IOmM浓度下，Zn2+、K+、Li+、Na+和β巯基乙醇对⑶SL蛋白的脂肪酶酶活有激活作用，其它离子对GDSL蛋白的脂肪酶酶活都会有不同程度的抑制作用，而Ca2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Mn2+和Pb2+的抑制效果最明显，剩余酶活均低于30%。四、有机溶剂对酶活的影响预处理在⑶SL蛋白液中加入不同有机试剂(体积百分含量为10%或30%)，40 °C反应lOmin。以加入等体积水的反应体系作为对照(CK)。将预处理后的蛋白液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。以CK处理组的酶活作为100%，计算各个处理组的相对酶活，结果见图12。在浓度10%时，甲醇、异丙醇和正辛醇对GDSL蛋白的脂肪酶酶活有微弱地激活作用，异丁醇具有抑制作用，其它有机溶剂对酶活几乎无影响。在浓度30%时，甲醇、异丙醇和正辛醇对GDSL蛋白的脂肪酶酶活仍具微弱地激活作用，异丁醇和乙醇对酶活有较强的抑制作用，其它有机溶溶剂对酶活仍无影响。五、不同去污剂对酶活的影响预处理在⑶SL蛋白液中加入不同去污剂(使去污剂的质量百分含量为O. 01%或O. 10%)，40°C反应lOmin。以加入等体积水的反应体系作为对照(CK)。将预处理后的蛋白液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用ρΗ7· 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。
以CK处理组的酶活作为100%，计算各个处理组的相对酶活，结果见图13。CTAB在低浓度或高浓度时均对GDSL蛋白的脂肪酶酶活具有激活作用，可提高酶活约20%。O. 1%的Txrion 100和PTTO对⑶SL蛋白的脂肪酶酶活有微弱地抑制作用，但是剩余酶活仍达80%以上。其它表面活性剂对酶活几乎无影响。六、抗蛋白酶能力测定预处理在⑶SL蛋白液中加入不同的蛋白酶，处理2小时。蛋白酶为胰蛋白酶时，加入剂量为150U，处理条件为pH 7.0、25°C。蛋白酶为蛋白酶K时，加入剂量为10U，处理条件为pH7. 5、37°C。蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶A时，加入剂量为5U，处理条件为pH 7.5，37 °C ο蛋白酶为胃蛋白酶时，加入剂量为18U，反应条件为pH 2.0，37°C。当蛋白酶为α-糜蛋白酶时，加入剂量为10U，反应条件为pH 7. 5，25°C。将预处理后的蛋白液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异仅在于采用PH7. 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。设置不进行预处理的对照(CK)。 以CK处理组的酶活作为100%，计算各个处理组的相对酶活，结果见图14。⑶SL蛋白经蛋白酶K、胃蛋白酶、糜蛋白酶、枯草蛋白酶和胰蛋白酶和处理后仍具有60%以上的脂肪酶活性，说明该酶具有一定的蛋白酶抗性。实施例4、GDSL蛋白作为脂肪酶对不同链长底物特异性的测定将实施例2的步骤四的4制备的GDSL蛋白液作为待测溶液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异如下(I)制备溶液A时，用其它底物取代对硝基苯酚棕榈酸酯并使底物浓度为ImM ; (2)采用pH7. 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。各个底物如下4_Nitrophenyl acetate (C2,对硝基苯基乙酸酯，SigmaN8130)、4_Nitrophenyl butyrate (C4, 丁酸对硝基苯酯，Sigma N9876)、4_Nitrophenylcaproate (C6,己酸对硝基苯酷，Sigma 956-75-2) 4_Nitrophenyl caprylate (C8，4_ 硝基苯基辛酸酷，Sigma 21742)、4_Nitro phenyl decanoate (CIO, 4-硝基苯基奏酸酷，SigmaN0252)、4_Nitrophenyl dodecanoate (C12, 4_ 硝基苯基月桂酸酷，Sigma61716)。当底物为4-Nitrophenyl acetate时，⑶SL蛋白液的酶活为166U/mL。当底物为4-Nitrophenyl butyrate时，⑶SL蛋白液的酶活为190U/mL。当底物为4-Nitrophenyl caproate时，⑶SL蛋白液的酶活为246U/mL。当底物为4-Nitrophenyl caprylate时，⑶SL蛋白液的酶活为297U/mL。当底物为4-Nitrophenyl decanoate时，⑶SL蛋白液的酶活为231U/mL。当底物为4-Nitrophenyl dodecanoate 时，GDSL 蛋白液的酶活为 109U/mL。以4-Nitrophenyl caprylate作为底物得到的酶活结果作为100%,计算采用其它底物的相对酶活。结果见图15。GDSL蛋白最大可降解链长为C12个碳链，在底物为C2-C8时降解能力随着链长的增加活性也相应地增加，底物为C2时相对活性达到56%。底物的链长大于C8后降解活性随之下降，ClO时为78%，C12时为37%。实施例5、重组酶动力学常数测定将实施例2的步骤四的4制备的GDSL蛋白液作为待测溶液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5,差异如下(I)制备溶液A时,用4-Nitrophenyl caprylate (或4-Nitrophenyl decanoate)取代对硝基苯酹棕榈酸酯并使其浓度为ImM ； (2)采用pH7. 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液；(3)依次在2、3、5、7、10、15、20、30min时终止酶活反应，并测定光吸收值。通过计算酶活性与反应时间的比值大小，如该酶在某个时间段内比值不变时，则在该时间段内的酶促反应为一级反应，来确定此时间内为测Km和Vmax的反应最佳时间。根据确定的一级反应时间,4-Nitrophenyl caprylate测定Km值及Vmax的反应时间为 lOmin, 4-Nitrophenyl decanoate 测定 Km 值及 Vmax 的反应时间为 lOmin。将实施例2的步骤四的4制备的GDSL蛋白液作为待测溶液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5，差异如下(1)制备溶液A时，用不同量的4-Nitrophenylcaprylate (或4-Nitrophenyl decanoate)取代对硝基苯酌·棕榈酸酯,使其浓度为1、0.8、O. 4、O. 2、O. 15 或 O. ImM ; (2)采用 ρΗ7· 5 的 50mmol/L 柠檬酸-Na2HPO4 缓冲液；(3)采用前段确定的反应时间。通过公式计算出反应速度，采用米氏方程双倒数方法求得Km值及Vmax。再按双倒 数作图法(Lineweaver-Burk法)来转化其结构式
「01411 I[m V I I IGDSL 蛋白对 C8 底物的 Kni=O. 26mmol/L, Vmax=149. 25 μ mol/min/mg。GDSL 蛋白对CIO 底物的 Km=O. 41mmol/L, Vmax=71. I μ mol/min/mg。实施例6、重组酶B2比活的测定比活力单位的定义为每毫克酶蛋白所含的酶活力单位。将实施例2的步骤四的4制备的GDSL蛋白液作为待测溶液进行酶活测定，方法参见实施例2的步骤三的5,差异如下(I)制备溶液A时,用4-Nitrophenyl caprylate取代对硝基苯酚棕榈酸酯，使其浓度为ImM ; (2)采用pH7. 5的50mmol/L柠檬酸-Na2HPO4缓冲液。通过伯乐公司的蛋白定量试剂盒测定GDSL蛋白液中的蛋白浓度。酶活与蛋白浓度的比值即为⑶SL蛋白的比活力。以C8为底物计算得到⑶SL蛋白的比活力是498U/mg。
权利要求
1.⑶SL蛋白的应用，为如下(I)或(2) (O制备脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物； 所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述(2)中，所述降解的反应条件为30-80°C>pH6. 5-8. O。
3.如权利要求I或2所述的应用，其特征在于所述(2)中，所述脂肪酶的底物为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。
4.如权利要求I至3中任一所述的应用，其特征在于所述GDSL蛋白为权利要求7所述方法制备得到的蛋白质。
5.将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将GDSL蛋白的编码基因插入载体pET_28a(+)的多克隆位点得到的重组质粒； 所述⑶SL蛋白是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于所述GDSL蛋白的编码基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列3自5’末端第I至792位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有脂肪酶活性的蛋白的DNA分子。
7.一种制备⑶SL蛋白的方法，是培养权利要求5或6所述的重组菌，得到⑶SL蛋白；所述GDSL蛋白是如下(a)或(b): (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。
8.一种降解脂肪酶的底物的方法，是采用GDSL蛋白降解脂肪酶的底物； 所述GDSL蛋白是如下(a)或(b) : (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表的序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述降解的反应条件为30-80°C、pH6. 5-8. O ;所述脂肪酶的底物为对硝基苯基乙酸酯、丁酸对硝基苯酯、4-硝基苯基辛酸酯、4-硝基苯基葵酸酯、4-硝基苯基月桂酸酯和4-硝基苯基棕榈酸酯中的至少一种。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述GDSL蛋白为权利要求7所述方法制备得到的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了GDSL蛋白在制备脂肪酶中的新用途。本发明提供了GDSL蛋白的应用，为如下(1)或(2)(1)制备脂肪酶；(2)降解脂肪酶的底物；所述GDSL蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明发现GDSL蛋白具有脂肪酶活性，将GDSL蛋白用作脂肪酶具有如下优点可以采用较高的反应温度；具有良好的热稳定性；可以在碱性条件下作用；具有良好的pH稳定性；对C2-C12的底物均可发挥作用；酶活力较高。本发明为涉及脂肪酶的工艺流程开辟了一条新途径，具有重大的经济价值。
文档编号C12P7/64GK102876643SQ201210356229
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者周志刚, 何夙旭, 徐俐, 杨雅麟, 张美超, 李青 申请人:中国农业科学院饲料研究所