重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物免疫领域，涉及重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途。
【背景技术】
[0002] 虽然人、畜、禽在免疫学结构方面存在差异，但针对抗原发生免疫反应的生物模式 方面存在很多共同点，在人类疾病防控领域普遍应用的免疫佐剂，在禽、畜体内同样发挥作 用。作为人类整体，其健康质量的提升、平均寿命的延长，很大部分得益于对各种可致流行 病的病原体的抵抗；而后者则依赖于针对各种病原体的疫苗的研发和免疫方法的建立。目 前在某些地区，病原体感染仍是威胁人类健康的重大杀手，如引起爱滋病的HIV感染、人畜 共患的SARS、禽流感、埃博拉病毒感染等，以及并非致命的感染如疟疾等。同时，对于一些非 感染性疾病，若其发病机制与免疫失功相关，如肿瘤，则也可应用疫苗接种途径，诱导机体 产生针对特定抗原(如肿瘤相关抗原）的免疫力，从而达到预防或治疗疾病的目的。
[0003] 除增强人类自身健康状况外，为人类提供足够并健康的畜、禽制品，也是提升人 类整体生活质量的保障手段之一。因此，研发适用于畜、禽生产的疫苗以促进养殖业的健康 发展，同样具有重大意义。
[0004] 决定疫苗成败的三个主要因素包括特异性抗原、佐剂和免疫途径，其中后两者常 为领域内公共待解决的问题，因此具有更重大的研宄意义。即便针对同一种抗原，采用不同 的佐剂或应用不同的免疫途径，都可能引起不同的免疫防治效果。目前公共卫生防治领域 常用的免疫途径仍为皮下粘膜或肌肉注射。随着生物医学技术的发展，近二十年在经粘膜 免疫途径方面开展了大量工作，被认为最终将取代传统免疫途径。与其对应的则是寻找新 型的免疫佐剂。目前被公认较有前景的粘膜免疫佐剂(也适合传统免疫途径)主要包括霍乱 毒素、大肠杆菌热敏感肠毒素和人工合成的非甲基化的CpG类寡核苷酸。
[0005] 在相当长的时间里，铝剂（以氢氧化铝为主，还有硫酸铝、氧化铝凝胶等）是唯一被 批准在美国使用的免疫佐剂。随后，在欧洲和加拿大上市的MF59,为角鲨烯squalene纳米 油剂，用于流感；在防治16/18型乳头状瘤病毒引起的宫颈癌疫苗Cervarix中，使用的是氢 氧化铝与单磷酸脂质A (MPL)的混合物（AS04)。2013年，为应对严重的禽流感威胁，美国FDA 紧急批准在H5N1疫苗中使用的佐剂AS03,是维生素 E、角鲨烯和polysorbate (聚山梨醇 酯，又称吐温80)的混合物；只是该疫苗未公开售用，但在卫生官员认为需要时可以使用。 目前世界上有上百种基于各种机制、具有各种结构、针对不同使用目的的佐剂候选制品，处 于研发的不同阶段。在我国，国家食品药品监督管理局于二〇〇五年十月十四日发布的"多 肽疫苗生产及质控技术指导原则"中也明确阐明："传统佐剂是在矿物胶基础上制成-氢氧 化铝、磷酸铝或磷酸钙，到目前为止批准使用的佐剂鲜为他类"。为此，研发基于我国自主创 新发现的新型免疫佐剂，具有重要的意义。
[0006] -种良好的佐剂能增强机体对特异性抗原的免疫应答，但本身不引起不需要的作 用。目前使用或在研的多数佐剂，作用机制主要包括两种方式：通过物理方法延长疫苗抗原 的作用时间，或通过刺激先天性免疫系统而放大机体针对抗原产生的特异性免疫反应。比 如动物实验中应用最多的不完全弗氏佐剂即通过其内油脂类物质保护抗原不被迅速稀释 降解，而完全弗氏佐剂中的菌体则刺激机体的免疫系统。虽然完全弗氏佐剂也可引起针对 其内菌体抗原的特异性免疫反应，但因为该佐剂内的细菌实为致病菌，所以针对其产生的 特异性抗体或细胞免疫效应细胞并不对宿主产生不良效果。现在已知弗氏佐剂中的菌体发 挥作用的主要机制是其各种结构成分如脂多糖、蛋白多糖、胞内DNA等病原体相关模式分 子（Pathogen-Associated Molec μ Lar Pattern)对宿主细胞上Toll样受体的激活，引起 后续免疫刺激效应。近些年研宄较多的基于CpG免疫刺激现象的佐剂，通过激活Toll样受 体9而活化抗原提呈细胞和B细胞，从而增强对抗原的反应。毒素类佐剂则通过刺激粘膜 局部的炎性反应，放大对抗原的免疫反应。目前基于CpG免疫刺激现象的佐剂研发比较引 人注目，主要由于以下原因：CpG免疫刺激现象较为明显；CpG类寡核苷酸容易制备；当CpG 寡核苷酸长度控制在一定范围内时，其免疫原性十分微弱；除了其核心部位的CpG序列不 能变更外，其侧翼序列可有很多的变通方法，因此较易以新的序列研发自己的产品。
[0007] 在来源于细菌的佐剂候选制剂中，基于鞭毛成分者也值得关注。首先，曾有文 献表明完整鞭毛具有佐剂效应（Ruiz AM, et al. Immunoprotection of mice against Trypanosoma cruzi with a lyophilized flagellar fraction of the parasite plus adjuvant. Immunol Lett 1986; 12:1-4)。至 1997 年 Toll 样受体系列被发现（Medzhitov R, et al. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997; 388:394-397)后，于 2001 年证实鞭毛的佐剂效应 是通过鞭毛体的主要部分（即鞭毛纤维）所含鞭毛蛋白FliC作用于Toll样受体5 (TLR5) 而实现的（Hayashi F, et al. The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 2001; 410:1099-1103)。目前国内外均 有部分专利对FliC相关制剂的佐剂性应用进行保护。以"鞭毛蛋白and佐剂"搜索国家 专利局的专利公布公告数据库，返回四条记录（图2)，申请人分别来自中国和法国，专利对 鞭毛蛋白在人或禽疫苗中的应用进行保护。必须指出的是，目前已有的国内外所有应用鞭 毛蛋白作为佐剂或者其他方面应用的专利（比如肿瘤治疗等）中所指的"鞭毛蛋白"，无一例 外均指由基因FliC编码的flagellin type B，因其对应于鞭毛体纤维部分，因此传统被称 为filament C (FliC)，与本专利所保护的FlgE是由不同基因编码的不同蛋白（表1)。采 用Pubmed的BLAST程序和SimGene的CLUSTALW2程序分别对二者进行同源比较，显示FliC 和FlgE在蛋白序列方面同源性极低。
[0008] 表1.绿脓杆菌PAOl菌株中，"鞭毛蛋白"与"鞭毛钩蛋白"的对比
【主权项】
1. 重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的用途为重组绿脓杆菌鞭 毛钩蛋白FlgE在制备免疫佐剂或疫苗中的用途。
2. 根据权利要求1所述的重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 免疫佐剂为用于预防或治疗肿瘤、感染性疾病的免疫佐剂。
3. 根据权利要求1所述的重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 疫苗为用于预防肿瘤或感染性疾病的疫苗。
4. 根据权利要求3所述的重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所述的 疫苗为禽类或畜类疫苗。
5. 根据权利要求2或3所述的重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的感染性疾病包括病毒感染性疾病、细菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病。
6. 根据权利要求2或3所述的重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的感染性疾病包括肺炎、脑膜炎、肠炎、禽流感或艾滋病。
7. 根据权利要求2或3所述的重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，其特征在于：所 述的肿瘤包括基底细胞癌、移行细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、恶性血管外皮瘤、恶性血管外皮 瘤、B细胞性恶性淋巴瘤、T细胞性恶性淋巴瘤或造釉细胞癌。
【专利摘要】本发明属于生物免疫领域，本发明公开了重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途，所述的用途为重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE在制备免疫佐剂或疫苗中的用途；尤其是免疫佐剂用于预防或治疗肿瘤或感染性疾病的用途。本发明提供了以绿脓杆菌PAO1株为模型菌株，证明重组表达的FlgE单体，可以刺激人角膜上皮细胞或小鼠肺组织发生炎性反应，并能表现出显著的佐剂效应，为其应用于免疫佐剂奠定了基础。
【IPC分类】A61P35-00, A61K39-39, A61K39-00, A61P31-00, A61P33-00, A61P31-04, A61P37-04
【公开号】CN104784687
【申请号】CN201510201954
【发明人】王宜强, 沈莹, 唐华, 邵联波
【申请人】苏州大学附属第一医院, 泰山医学院
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月27日