杀虫蛋白的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种CrylA. 105蛋白质通过在植物 中表达来控制高粱条螟为害植物的用途。
【背景技术】
[0002] 高粱条螟Chilo sacchariphagus属鳞翅目，螟蛾科。又名甘鹿条螟，或高粱钻心 虫。主要分布在东亚、南亚、东南亚及印度洋地区。国内分布极广，东北、华北、华东和华南 大部份地区都有发生。可为害玉米、高粱、粟、麻、甘蔗等作物。在北方旱粮地区，主要为害 玉米、高粱和粟等作物，并常和玉米螟混合发生，造成枯心苗；同时也是南方甘蔗上的主要 害虫。
[0003] 玉米是中国重要的粮食作物，随着全球温室效应的加强，近两年温度不断上升，虫 害发生种类及数量都有所提高。高粱条螟以幼虫在初期为害心叶，后期则可蛀食茎杆、叶 鞘，阻碍养分输送，使茎杆易受风折断。对产量有严重影响，通常损失可达10% -40%。为 了防治高粱条螟，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治和物理防治。
[0004] 农业防治是把整个农田生态系多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因 素、创造一个有利于作物生长而不利于高粱条螟发生的农田生态环境。在越冬幼虫化蛹与 羽化之前，将高粱或玉米秸杆处理完毕，以减少越冬虫源。秸杆处理可采用粉碎、烧毁、怄 肥、铡碎、泥封等不同方法。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局 限性，不能作为应急措施，在高粱条螟爆发时就显得无能为力。
[0005] 化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是高粱条螟综合治理的重 要组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是高粱条螟大发生的情况 下，是必不可少的应急措施。高粱条螟作为蛀茎害虫，对其的防治时期把握非常重要，用药 最佳时期是卵孵盛期至幼虫蛀茎之前，否则高龄幼虫蛀入茎杆之后，将很难达到防治的目 的。目前化学防治方法主要是药液喷雾和施撒毒土。但化学防治也有其局限性，如使用不 当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境，使农田生态系 统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
[0006] 物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如 光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广 泛的是频振式杀虫灯诱杀，它利用害虫成虫的趋光性，近距离用光，远距离用波，引诱害虫 靠近，对高粱条螟成虫的具有一定的防治效果；但是频振式杀虫灯需要每天及时清理高压 电网上的污垢，否则会影响杀虫效果；并且在雷雨天不能开灯，在操作上还有电击伤人的危 险；此外安装灯的一次性投入较大。
[0007] 为了解决农业防治、化学防治和物理防治在实际应用中的局限性，科学家们经过 研宄发现将来自于苏云金芽孢杆菌的编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗 虫转基因植物以防治植物虫害。
[0008] 上述杀虫蛋白在易感的昆虫宿主采食后具有毒性。在过去几十年里，对苏云金芽 孢杆菌杀虫蛋白的结构和功能的研宄成为研宄热点，尽管这些蛋白在特定结构和功能方面 存在差别，但总体上来说其存在着一定一般化模式，包括：被昆虫采食，溶解在特定昆虫宿 主的胃肠中部，昆虫宿主部分消化酶对蛋白进行消化激活，与胃肠中部细胞结合，在昆虫细 胞上形成一个孔并破坏细胞内部平衡。CrylAb、CrylAc、CrylFa以及Cry2Ab都是属于此 类蛋白，且这些蛋白被证实导入植物中后，可使得植物产生抗虫功能。CrylA. 105杀虫蛋白 是众多杀虫蛋白中的一种，CrylA. 105蛋白是一个嵌合蛋白，它分别来自于CrylAb蛋白、 CrylAc蛋白和CrylFa蛋白。
[0009] CrylA. 105蛋白被易感昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱 性PH环境下。蛋白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段 和易感昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病灶，破坏 细胞膜内外的渗透压变化及PH平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
[0010] 已证明转CrylA. 105基因的植株可以抵抗玉米螟等鳞翅目Lepidoptera害虫的侵 害，然而，至今尚无关于通过产生表达CrylA. 105蛋白的转基因植株来控制高粱条螟对植 物危害的报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达CrylA. 105 蛋白的转基因植株来控制高粱条螟对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化 学防治和物理防治等技术缺陷。
[0012] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制高粱条螟害虫的方法，包括将高粱条螟 害虫至少与CrylA. 105蛋白接触。
[0013] 进一步地，所述CrylA. 105蛋白存在于至少产生所述CrylA. 105蛋白的宿主细胞 中，所述高粱条螟害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述CrylA. 105蛋白接触。
[0014] 更进一步地，所述CrylA. 105蛋白存在于至少产生所述CrylA. 105蛋白的细菌或 转基因植物中，所述高粱条螟害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述 CrylA. 105蛋白接触，接触后所述高粱条螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对高 粱条螟危害植物的控制。
[0015] 在上述技术方案中，所述转基因植物可以处于任意生育期；所述转基因植物的组 织为根、叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花蕾、花药或花丝；所述对高粱条螟危害植物的控制 不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
[0016] 所述植物来自玉米、高粱、甘蔗、粟、麻或薏米。
[0017] 所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述CrylA. 105蛋白的多核苷酸的植 物。
[0018] 优选地，所述CrylA. 105蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 所述CrylA. 105蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0019] 在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述 CrylA. 105蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
[0020] 进一步地，所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶 抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。
[0021] 优选地，所述第二种核苷酸编码Cry2Ab蛋白。
[0022] 更进一步地，所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列具有SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序 列，所述第二种核苷酸具有SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列。
[0023] 可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0024] 为实现上述目的，本发明还提供了一种Cry 1A. 105蛋白质控制高粱条螟害虫的用 途。
[0025] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制高粱条螟害虫的植物的方法，包 括向所述植物的基因组中引入编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制高粱条螟害虫的植物繁殖体的方 法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，和/或取下由所述方法获得的植 株上具有繁殖能力的组织进行培养，从而产生含有编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的 植物繁殖体。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制高粱条螟害虫的植物的方法，包 括：
[0028] 种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码CrylA. 105蛋白 的多核苷酸序列；
[0029] 使所述植物繁殖体长成植株；
[0030] 使所述植株在人工接种高粱条螟害虫和/或高粱条螟害虫自然发生危害的条件 下生长，收获与其他不具有编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植 物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
[0031] 本发明中所述的"植物繁殖体"包括但不限于植物有性繁殖体和植物无性繁殖体。 所述植物有性繁殖体包括但不限于植物种子；所述植物无性繁殖体是指植物体的营养器官 或某种特殊组织，其可以在离体条件下产生新植株；所述营养器官或某种特殊组织包括但 不限于根、茎和叶，例如：以根为无性繁殖体的植物包括草莓和甘薯等；以茎为无性繁殖体 的植物包括甘蔗和马铃薯（块茎）等；以叶为无性繁殖体的植物包括芦荟和秋海棠等。
[0032] 本发明中所述的"接触"，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器 官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达 杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或 具有产生杀虫蛋白的微生物。
[0033] 本发明术语"控制"和/或"防治"是指高粱条螟害虫至少与CrylA. 105蛋白接触， 接触后高粱条螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，高粱条螟害虫通过摄食植 物组织至少与CrylA. 105蛋白接触，接触后全部或部分高粱条螟害虫生长受到抑制和/或 导致死亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面 的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方 法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码CrylA. 105蛋白的多核苷酸序列的 控制高粱条螟害虫的植物和/或植物繁殖体，在人工接种高粱条螟害虫和/或高粱条螟害 虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现 包括但不限于改善的茎杆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。CrylA. 105蛋白对高 粱条螟的"控制"和/或"防治"作用是可以独立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治" 高粱条螟害虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物（含有编码CrylA. 105 蛋白的多核苷酸序列）的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，CrylA. 105蛋白 和/或可控制高粱条螟害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响CrylA. 105 蛋白对高粱条螟的"控制"和/或"防治"作用，也不能导致所述"控制"和/或"防治"作用 完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与CrylA. 105蛋白无关。通常情况下，在大田， 高粱条螟害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种高粱条螟 害虫和/或高粱条螟害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物（含有编码CrylA. 105蛋 白的多核苷酸序列）的任何组织存在死亡的高粱条螟害虫、和/或在其上停留生长受到抑 制的高粱条螟害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现 了本发明的方法和/或用途，即通过高粱条螟害虫至少与CrylA. 105蛋白接触以实现控制 高粱条螟害虫的方法和/或用途。
[0034] 在本发明中，CrylA. 105蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个 Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转 基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种 植物（第1亲本）可以通过遗传工程操作表达CrylA. 105蛋白质，第二种植物（第2亲本） 可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和 第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0035] RNA干扰（RNA interf