糖质氧化酶、其制备方法以及用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有糖质氧化酶活性的蛋白质。更详言之，涉及作用于大范围的糖的 具有糖质氧化酶活性的蛋白质、编码该蛋白质的基因、含有该基因的重组载体、转染体、以 及上述蛋白质的制备方法及上述蛋白质的用途。
【背景技术】
[0002] 作为对糖质进行氧化的酶的代表，有将葡萄糖氧化的葡萄糖氧化酶，这种葡萄糖 氧化酶在各种领域被广泛使用。
[0003] 例如，在制备干燥蛋白的过程中，为了除去蛋白中的葡萄糖（脱糖）而使用葡萄糖 氧化酶。干燥蛋白与生蛋白相比能够长期保存，输送成本低，保管空间小，从这些方面考虑， 被用作各种食品的原料。该干燥蛋白中的葡萄糖在保存中与鸡蛋蛋白质中的氨基反应，发 生美拉德反应，出现褐变，并产生不愉快的气味。为了防止这样的品质下降，采用以除去蛋 白中的葡萄糖为目的而使用葡萄糖氧化酶、酵母等的发酵法。
[0004] 但是，因为葡萄糖氧化酶的温度稳定性比较优异，所以产品中有时残留葡萄糖氧 化酶活性。例如，在干燥蛋白中残存葡萄糖氧化酶活性时，出现使用干燥蛋白制作点心时原 料中的葡萄糖被氧化的问题。另一方面，存在如下问题：在葡萄糖氧化酶失活的条件下进行 热处理时，蛋白凝固，导致作为干燥蛋白的商品价值下降。另外，通过酵母发酵而脱去葡萄 糖的方法存在干燥蛋白产品中残留发酵味的问题。
[0005] 另外，在面包制作厂、面粉厂中，为了提高小麦粉的烧固性，改善伸缩性，制作具有 所希望的强度以及稳定性的面团，使用葡萄糖氧化酶。作为这种效果的背景机制，可以说是 将坯料中的葡萄糖氧化，生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，生成的过氧化氢作为氧化剂起作 用，有助于形成面筋S-S键。由此，蛋白质形成更稳定的形态，从而改善面团的品质、烧固 产品的容量以及芯构造。
[0006] 具体而言，例如在专利文献1中公开了为了改善面团的流动学特征、焙烧后的面 包的纹理以及外观而在谷粉中添加葡萄糖氧化酶的技术。另外，在专利文献2中公开了用 于改善含有纤维素分解酶以及葡萄糖氧化酶的面包的性质的制剂。进而，专利文献3中，公 开了含有葡萄糖氧化酶以及脂肪酶的面包制作改良剂以及使用其的面包制作方法。
[0007] 像这样地葡萄糖氧化酶被用于各种用途，因为是仅将葡萄糖氧化的酶，所以存在 对于不含葡萄糖或者其含量低的物质无法发挥有效的效果的问题。另外，在含有乳糖等其 他糖质的情况下，如果不并用例如乳糖酶等能够将其他糖质分解成葡萄糖的酶，就无法得 到有效的效果。
[0008] 例如为了使用葡萄糖氧化酶作为对面团以及面包进行改良的添加剂，作为基质， 必须存在葡萄糖，一般来说小麦粉中的葡萄糖为0~0. 4重量％的低含量，所以限制了葡萄 糖氧化酶的有用性。另一方面，已知谷物粉中麦芽糖含量比葡萄糖含量高。
[0009] 为了解决以上的课题，开始关注作用于葡萄糖之外的糖质的糖质氧化酶。例如，专 利文献4中公开了涉及对D-葡萄糖、D-乳糖、D-纤维二糖、D-麦芽三糖、D-麦芽四 糖、D -麦芽五糖、D -麦芽六糖、D -麦芽七糖各基质显示良好的反应活性的低聚糖氧化酶 的技术。另外，在专利文献5中公开了通过使用相比葡萄糖将麦芽糊精或纤维糊精优先氧 化的来自属于微结节菌属（Microdochium属）的微生物的糖质氧化酶，改善面还或面包的 特性的技术。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:美国专利公开第2783150号
[0013] 专利文献2:加拿大专利第2012723号
[0014] 专利文献3:日本特开平4 一 84848号公报
[0015] 专利文献4:日本特开平5 - 84074号公报
[0016] 专利文献5:日本特表2001 - 526058号公报
【发明内容】
[0017] 只要是不仅将葡萄糖这样的单糖类氧化，也将二糖类以上的糖质氧化的酶，与葡 萄糖氧化酶相比，就能够期待在更广泛领域中的用途。
[0018] 本发明中，以提供能够应对各种用途的具有糖质氧化酶活性的新型蛋白质作为主 要目的。
[0019] 本申请人等对具有糖质氧化酶活性的蛋白质进行深入研宄，结果成功地生产出作 用于广泛的糖、并且、具有适度的温度稳定性的蛋白质，完成了本发明。
[0020] SP，本发明中提供以下的[1]~[32]。
[0021] [1]
[0022] 一种具有以下理化性质的蛋白质，即，
[0023] (1)作用：将糖氧化而形成糖酸；
[0024] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维 二糖；以及
[0025] (3)[葡萄糖的Km值]/ [麦芽糖的Km值]彡1。
[0026] [2]
[0027] [1]中记载的蛋白质，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0028] [3]
[0029] 一种具有以下理化性质的蛋白质，即，
[0030] (1)作用：将糖氧化而形成糖酸；
[0031] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维 二糖；
[0032] (3)分子质量：约63kDa(通过SDS - PAGE法测定）。
[0033] [4]
[0034] [3]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0035] [5]
[0036] [4]中记载的蛋白质，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0037] [6]
[0038] -种具有以下理化性质的蛋白质，即，
[0039] (1)作用：将糖氧化而形成糖酸；
[0040] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维 二糖；
[0041] (3)最佳 pH: 5.0 ~9.0 ;
[0042] (4)稳定 pH 范围：5.0 ~10.5 ;
[0043] (5)最佳温度：2(TC ~55°C ;
[0044] (6)温度稳定性：在45°C以下稳定；以及
[0045] (7)分子质量：约63kDa(通过SDS - PAGE法测定）。
[0046] [7]
[0047] [6]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0048] [8]
[0049] [7]中记载的蛋白质，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0050] [9]
[0051] 具有以下理化性质的来自枝顶孢属（Acremonium属）微生物的蛋白质，即，
[0052] (1)作用：将糖氧化成糖酸；
[0053] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维 二糖；以及
[0054] (3)[葡萄糖的Km值]/ [麦芽糖的Km值]彡1。
[0055] [10]
[0056] [9]中记载的蛋白质，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0057] [11]
[0058] 具有以下理化性质的来自枝顶孢属（Acremonium属）微生物的蛋白质，即，
[0059] (1)作用：将糖氧化成糖酸；
[0060] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维 二糖；以及
[0061] (3)分子质量：约63kDa(通过SDS - PAGE法测定）。
[0062] [12]
[0063] [11]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0064] [13]
[0065] [12]中记载的蛋白质，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0066] [14]
[0067] 具有以下理化性质的来自枝顶孢属（Acremonium属）微生物的蛋白质，即，
[0068] (1)作用：将糖氧化成糖酸；
[0069] (2)基质特异性：作用于葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维 二糖；
[0070] (3)最佳 pH: 5.0 ~9.0 ;
[0071] (4)稳定 pH 范围：5.0 ~10.5 ;
[0072] (5)最佳温度：2(TC ~55°C ;
[0073] (6)温度稳定性：在45°C以下稳定；以及
[0074] (7)分子质量：约63kDa(通过SDS-PAGE法测定）。
[0075] [15]
[0076] [14]中记载的蛋白质，其中，[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0077] [16]
[0078] [15]中记载的蛋白质，其中，0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0079] [17]
[0080] [9]~[16]中记载的蛋白质，其中，上述枝顶孢属（Acremonium属）微生物是顶头 抱霉（Acremonium chrysogenum) 〇
[0081] [18]
[0082] 以下的（a)、（b)或（c)中记载的蛋白质，即，
[0083] (a)由序列号10所表示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0084] (b)由在序列号10所表示的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1~数个氨基酸 而得的氨基酸序列组成的、具有糖质氧化酶活性的蛋白质；
[0085] (c)由与序列号10所表示的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸组成的、 具有糖质氧化酶活性的蛋白质。
[0086] [19]
[0087] -种基因，编码[18]中记载的蛋白质。
[0088] [20]
[0089] 一种基因，由以下的（a)、（b)或（c)中记载的DNA组成，即，
[0090] (a)由序列号6所表示的碱基序列组成的DNA ;
[0091] (b)由在序列号6所表示的碱基序列中缺失、取代及/或添加1~数个碱基而得的 碱基序列组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA ;以及
[0092] (c)由与序列号6所表示的碱基序列具有90%以上的同源性的碱基组成的、编码 具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA。
[0093] [21]
[0094] -种基因，由以下的（a)、（b)或（c)中记载的DNA组成，即，
[0095] (a)由序列号9所表示的碱基序列组成的DNA ;
[0096] (b)由在序列号9所表示的碱基序列中缺失、取代及/或添加1~数个碱基而得的 碱基序列组成的、编码具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA ;以及
[0097] (c)由与序列号9所表示的碱基序列具有90%以上的同源性的碱基组成的、编码 具有糖质氧化酶活性的蛋白质的DNA。
[0098] [22]
[0099] 一种重组载体，含有[19]~[21]中的任一项所述的基因。
[0100] [23]
[0101] 一种转染体，通过[22]中记载的重组载体对宿主细胞进行转染而得。
[0102] [24]
[0103] -种蛋白质的制备方法，从培养物中采集[1]~[18]中的任一项所述的蛋白质， 所述培养物是通过在营养培养基中对具有生产[1]~[18]中的任一项所述的蛋白质的能 力的微生物进行培养而得到的物质。
[0104] [25]
[0105] 一种蛋白质的制备方法，将[23]所述的转染体在培养基中进行培养，从培养物中 收集具有糖质氧化酶活性的蛋白质。
[0106] [