杀虫蛋白的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种Vip3A蛋白质通过在植物中表 达来控制二化螟为害植物的用途。
【背景技术】
[0002] 二化螟Chilosuppressalis属鳞翅目，螟蛾科，在我国南北稻区广泛分布的常发 性害虫之一。在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减 产3% -5%，严重时减产在3成以上，给当前的水稻生产造成严重威胁。
[0003] 水稻是中国重要的粮食作物，随着全球温室效应的加强，近两年温度不断上升，虫 害发生种类及数量都有所提高。每年因二化螟造成的粮食损失巨大，更甚者影响到当地人 口的生存状况。为了防治二化螟，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治和 物理防治。
[0004] 农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因 素、创造一个有利于作物生长而不利于二化螟发生的农田生态环境。可以采取调整水稻播 种期、处理稻茬、灌水灭虫、拔出白穗等措施，以达到消灭一定数量害虫的目的。因农业防治 必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局限性，不能作为应急措施，在二化螟爆发 时就显得无能为力。
[0005] 化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是二化螟综合治理的重要 组成部分，它具有快速、方便、简便和高经济效益的特点，特别是二化螟大发生的情况下，是 必不可少的应急措施。二化螟作为蛀茎害虫，对其的防治时期把握非常重要，用药最佳时期 是卵孵盛期至幼虫蛀茎之前，否则高龄幼虫蛀入茎杆之后，将很难达到防治的目的。目前化 学防治方法主要是药液喷雾。但化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发 生药害、害虫产生抗药性，以及减少天敌、污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留 对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
[0006] 物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如 光、电、色、温湿度等以及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广泛 的是频振式杀虫灯诱杀，它利用害虫成虫的趋光性，近距离用光，远距离用波，引诱害虫靠 近，对二化螟成虫的防治具有一定的效果；但是频振式杀虫灯需要每天及时清理高压电网 上的污垢，否则会影响杀虫效果；并且在雷雨天不能开灯，在操作上还有电击伤人的危险； 此外安装灯的一次性投入较大。
[0007] 为了解决农业防治、化学防治和物理防治在实际应用中的局限性，科学家们经过 研宄发现将来自于苏云金芽孢杆菌的编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗 虫转基因植物以防治植物虫害。Vip3A杀虫蛋白是众多杀虫蛋白中的一种，是由蜡状芽孢杆 菌产生的特异性蛋白质。
[0008] Vip3A蛋白通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。 Vip3A蛋白在昆虫肠道内被水解为4种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物（33KD) 为Vip3A蛋白的毒性核心结构。Vip3A蛋白结合敏感昆虫的中肠上皮细胞，启动细胞程序性 死亡，造成中肠上皮细胞的溶解导致昆虫死亡。对非敏感昆虫不产生任何病症，不会导致中 肠上皮细胞的凋亡和溶解。
[0009] 已证明转Vip3A基因的植株可以抵抗小地老虎、草地贪夜蛾、大螟、水稻夜蛾等鳞 翅目Lepidoptera害虫的侵害，然而，至今尚无关于通过产生表达Vip3A蛋白的转基因植株 来控制二化螟对植物危害的报道。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达Vip3A蛋白 的转基因植株来控制二化螟对植物危害的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治 和物理防治等技术缺陷。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种控制二化螟害虫的方法，包括将二化螟害虫 至少与Vip3A蛋白接触。
[0012] 进一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少产生所述Vip3A蛋白的宿主细胞中，所述二 化螟害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述Vip3A蛋白接触。
[0013] 更进一步地，所述Vip3A蛋白存在于至少产生所述Vip3A蛋白的细菌或转基因植 物中，所述二化螟害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述Vip3A蛋白 接触，接触后所述二化螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对二化螟危害植物的 控制。
[0014] 所述转基因植物可以处于任意生育期。
[0015] 所述转基因植物的组织为根、叶片、茎杆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
[0016] 所述对二化螟危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
[0017] 所述植物来自水稻、甘蔗、茭白、玉米、高粱、大豆、油菜、麦类、粟或稗。
[0018] 所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Vip3A蛋白的多核苷酸的植物。
[0019] 优选地，所述Vip3A蛋白的氨基酸序列具有SEQIDNO: 1或SEQIDNO: 3所示的 氨基酸序列。所述Vip3A蛋白的核苷酸序列具有SEQIDNO: 2或SEQIDNO: 4所示的核苷 酸序列。
[0020] 在上述技术方案的基础上，所述植物还可以包括至少一种不同于编码所述Vip3A 蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
[0021] 进一步地，所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶 抑制剂、凝集素、a-淀粉酶或过氧化物酶。
[0022] 优选地，所述第二种核苷酸编码CrylAb蛋白。
[0023] 更进一步地，所述CrylAb蛋白的氨基酸序列具有SEQIDN0:5所示的氨基酸序 列，所述第二种核苷酸具有SEQIDN0:6所示的核苷酸序列。
[0024] 可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
[0025] 为实现上述目的，本发明还提供了一种Vip3A蛋白质控制二化螟害虫的用途。
[0026] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制二化螟害虫的植物的方法，包括 向所述植物的基因组中引入编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列。
[0027] 为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制二化螟害虫的植物繁殖体的方 法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，和/或取下由权利要求18所述方 法获得的植株上具有繁殖能力的组织进行培养，从而产生含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸 序列的植物繁殖体。
[0028] 为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制二化螟害虫的植物的方法，包 括：
[0029] 种植至少一个植物繁殖体，所述植物繁殖体的基因组中包括编码Vip3A蛋白的多 核苷酸序列；
[0030] 使所述植物繁殖体长成植株；
[0031] 使所述植株在人工接种二化螟害虫和/或二化螟害虫自然发生危害的条件下生 长，收获与其他不具有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和 /或具有增加的植物产量的植株。
[0032] 本发明中所述的"植物繁殖体"包括但不限于植物有性繁殖体和植物无性繁殖体。 所述植物有性繁殖体包括但不限于植物种子；所述植物无性繁殖体是指植物体的营养器官 或某种特殊组织，其可以在离体条件下产生新植株；所述营养器官或某种特殊组织包括但 不限于根、茎和叶，例如：以根为无性繁殖体的植物包括草莓和甘薯等；以茎为无性繁殖体 的植物包括甘蔗和马铃薯（块茎）等；以叶为无性繁殖体的植物包括芦荟和秋海棠等。
[0033] 本发明中所述的"接触"，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器 官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达 杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或 具有产生杀虫蛋白的微生物。
[0034] 本发明术语"控制"和/或"防治"是指二化螟害虫至少与Vip3A蛋白接触，接触 后二化螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，二化螟害虫通过摄食植物组织至 少与Vip3A蛋白接触，接触后全部或部分二化螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制 是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如 生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用 于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列的控制二化螟害虫 的植物和/或植物繁殖体，在人工接种二化螟害虫和/或二化螟害虫自然发生危害的条件 下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎 杆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Vip3A蛋白对二化螟的"控制"和/或"防 治"作用是可以独立存在的，不因其它可"控制"和/或"防治"二化螟害虫的物质的存在而 减弱和/或消失。具体地，转基因植物（含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何组 织同时和/或不同步地，存在和/或产生，Vip3A蛋白和/或可控制二化螟害虫的另一种物 质，则所述另一种物质的存在既不影响Vip3A蛋白对二化螟的"控制"和/或"防治"作用， 也不能导致所述"控制"和/或"防治"作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与 Vip3A蛋白无关。通常情况下，在大田，二化螟害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼 观察到，因此，在人工接种二化螟害虫和/或二化螟害虫自然发生危害的条件下，如转基因 植物（含有编码Vip3A蛋白的多核苷酸序列）的任何组织存在死亡的二化螟害虫、和/或 在其上停留生长受到抑制的二化螟害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的 植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过二化螟害虫至少与Vip3A蛋白接触 以实现控制二化螟害虫的方法和/或用途。
[0035] 在本发明中，Vip3A蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry 类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因 植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物 (第1亲本）可以通过遗传工程操作表达Vip3A蛋白质，第二种植物（第2亲本）可以通过 遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本 杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
[0036] RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链 RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。因此在本 发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
[0037] 在分类系统上，一般主要根据成虫翅的脉序、连锁方式和触角的类型等形态特征， 将鳞翅目分为亚目、总科、科等，而螟蛾科是鳞翅目中种类最多的科之一，全