苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-1基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-l基因， 属于生物化学技术领域。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt)在《伯杰氏细菌鉴定手 册》第九版中归属于第二类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种。它形成芽胞的 过程中，在菌体内的一端或两端形成一个或多个形状一致或不同的伴胞晶体（parasporal crystal)。这种伴胞晶体的主要成分是具有杀虫活性的蛋白质，故又称为杀虫晶体蛋 白（ICPs)或8 -内毒素（6 -endotoxin)。该杀虫晶体蛋白由cry基因和cyt基因编 码，现在已经发现苏云金芽胞杆菌大多数菌株都能产生多种类型的晶体蛋白，对鳞翅目 (Lepidoptera)、双翅目（Diptera)、銷翅目（Coleoptera)、膜翅目（Hymenoptera)、同翅目 (Homoptera)、直翅目（Orthoptera)、食毛目（Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和 原生动物等具有特异性的杀虫活性（G. M. Faust等1983 ;D. L. Edwards等1988 ;F. Baroy等 1998)。据估计，已分离的Bt菌株超过了 5万株，Bt的杀虫范围已经扩大到包括大量农林及 卫生害虫在内的无脊椎的4个门和节肢动物门中9个目的生物（郑大胜等2002)。Bt对人 畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。近年来，人们发现 Bt在营养期分泌的一类新型杀虫毒蛋白即营养期杀虫蛋白（VIPs)，它不同于Bt的杀虫晶 体蛋白，是一种在Bt营养生长中期和产胞期分泌到细胞外的毒素蛋白，直至稳定前期达到 最高峰（J J Estruch 等 1996 ;G. W. Warren 等 1998 ; J. J. Estruch 等 2000)，它一般不形成伴 胞晶体。具有热不稳定性（E. Schnepf?等1998);对鳞翅目、鞘翅目昆虫具有较广谱的杀虫活 性，甚至是一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫如小地老虎都有较强活性，而且对草 地贪夜蛾、甜菜夜蛾、烟蚜夜蛾、棉铃虫等一系列害虫都有活性（L. L. Loguercio等2002)， 毒效都在纳克（ng)水平上。该蛋白的发现使得Bt杀虫剂在杀虫活性、杀虫范围方面得到 很大突破，在一定程度上克服了许多害虫对Bt内毒素低敏感或不敏感的弊端。可见，VIPs 是一个极为丰富而且是具有巨大潜力的资源。该领域已成为Bt研宄的热点。PCR鉴定体系 的建立和应用，极大地加快了 Bt菌株筛选、生物活性测定、新基因的分离克隆等项研宄的 速度。研宄表明，通过PCR和生物活性测定相结合是收集Bt中营养期杀虫蛋白活性的首选 策略（L. L. Loguercio等2002)。vip基因的发现与鉴定对于研宄Bt资源的多样性、预测其 杀虫活性、快速筛选优良菌株、分离克隆新的vip基因有十分重要的意义。甜菜夜蛾，学名： Laphygma exigua Hubner，英文名：Beet army worm，别名：贪夜蛾。形态：幼虫体色变化很 大，有绿色、暗绿色、黄褐色、黑褐色等，腹部体侧气门下线为明显的黄白色纵带，有时呈粉 红色。成虫昼伏夜出，有强趋光性和弱趋化性，大龄幼虫有假死性，老熟幼虫入土吐丝化蛹。 主要食物：甜菜夜蛾为害多种蔬菜，如甘蓝、花椰菜、白菜、萝卜、莴苣、番茄、青椒、茄子、马 铃薯、黄瓜、西萌芦、豆类、茴香、韭菜、菠菜、芹菜、胡萝卜等。虫态：虫态有成虫、卵、幼虫、 蛹，以幼虫为害植株。初孵幼虫群集叶背，吐丝结网，在叶内取食叶肉，留下表皮，成透明的 小孔；3龄后可将叶片吃成孔洞或缺刻；大龄幼虫还可钻蛀青椒、番茄果实。发生规律和危 害特点：初龄幼虫在叶背群集吐丝结网，食量小，3龄后，分散为害，食量大增，昼伏夜出，危 害叶片成孔缺刻，严重时，可吃光叶肉，仅留叶脉，甚至剥食茎杆皮层。幼虫可成群迀飞，稍 受震扰吐丝落地，有假死性。3-4龄后，白天潜于植株下部或土缝，傍晚移出取食为害。一年 发生6-98代，7-8月发生多，高温、干旱年份更多，常和斜纹夜蛾混发，对叶菜类威胁甚大。 甜菜夜蛾这种间隙性大发生的杂食性害虫，自上世纪90年代开始在棉区发生危害以来，近 些年的发生危害呈现逐渐加重的趋势，已经扩展到甘蓝、白菜、番茄、青椒、马铃薯、芹菜等 多种蔬菜及大豆等170余种植物。近年来甜菜夜蛾为害猖獗，暴发成灾，许多农民频繁用药 仍防效不佳，只得每天早晚到田里捕捉，望田兴叹。比如一般棉田为害株率60%左右，严重 地块达100%，一旦发生，棉农往往束手无措，直接影响到棉农种棉的经济效益，对棉花生产 构成严重威胁。如何寻找到苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的基因成为急需 解决的一大难题？所以，发明苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-l基 因，寻找到一个表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力以应用于害虫生物防治的苏云金芽胞杆菌 vip3A-l基因是必要的。
【发明内容】
[0003] 为了克服寻找苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力基因的难题，本发明 提供了一个苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A-l基因，该苏云金芽胞 杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾生物活性试验进行初筛和复筛，7d后分别调查死、活虫数，计算校 正死亡率和LC 5(I，结果可知，苏云金芽胞杆菌的vip3A-l基因表达蛋白在复筛时对甜菜夜蛾 半致死浓度为7. 755 y g/g (5. 683-9. 979 y g/g)，当表达蛋白浓度达到81 y g/g时，所有甜 菜夜蛾均死亡，可见vip3A-l基因表达蛋白对甜菜夜蛾具有高毒力。
[0004] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005] 苏云金芽胞杆菌表达蛋白对甜菜夜蛾有高毒力的vip3A_l基因的核酸序列为Seq ID No: 1，具体构建及验证过程如下：
[0006] 1.基因的PCR扩增：将提取的Bt菌基因组DNA使用vip-5/vip-3引物对进行PCR 扩增，引物序列见表1。参照GenBank中公布的vip3A基因编码区的N端和C端序列同源 性，设计合成一对特异性引物vip-5/vip_3,分别在5'端引入Ndel和Sail酶切位点（箭头 所示），用于扩增全长基因。
[0007] 2. 2. PCR反应体系：K0D聚合酶反应体系50yL;K0D酶lyL;引物对（lOmmol/ L) 1 y L ;模板 1 y L ; 10x PCR Buffer 5 y L ;MgS043 y L ;dNTP 5 y L ;ddH20 补足至 50 y L ;
[0008] 3. PCR反应条件（表2)
[0009] 4.DNA回收：⑴使用灭菌解剖刀切下含目的DNA片段的凝胶，置于1.5mL离心中； (2)加入3倍体积溶胶的溶胶缓冲液A，置于50°C水浴锅中lOmin左右；（3)待胶完全溶解 后加入0. 5个A溶胶缓冲液体积的B溶液；(4)混匀后转入回收柱，12000r/min离心lmin ; (5)去除残留液体，加入洗脱缓冲液W1500 y L，12000r/min离心lmin ; (6)去除残留液体， 洗脱缓冲液W2700 y L，洗脱两次；（7)将30 y L的TE溶液加入回收柱中，室温静置2min ; (8) 将上步回收柱12000r/min离心lmin，备用。如需要可以重复7-8步骤一次。
[0010] 5.连接反应：将DNA胶回收产物与pEB载体按照连接体系（目的片段DNA 4 y L， 载体DNA 1 y L，连接试剂盒Solution I 5 y L)进行连接反应。充分混匀后，16°C连接4h或 4°C条件下连接过夜。
[0011] 6.大肠杆菌热激转化：将连接产物全量加入到100 y L大肠杆菌JM109的感受态 细胞中，混匀，冰浴30min以上，取出离心管42°C准确热击90s，再冰浴3min，加入900 y L LB 液体培养基37°C培养lh左右，取200 yL于LB固体平板涂布，加入相应的抗生素，X-gal溶 液40 y L，IPTG溶液4 y L，37°C培养过夜，进行蓝白班筛选，筛选出方向连接正确的阳性克 隆，以PEB载体的正向引物pEBF和所克隆基因的反向引物进行PCR鉴定。提取阳性克隆菌 株的质粒，转入大肠杆菌Rosetta菌株感受态细胞中。经PCR、酶切等鉴定后再通过序列测 定，鉴定出的正确重组转化