专利名称：苏云金芽胞杆菌的增效蛋白基因bell及应用的制作方法
技术领域：
本发明属农业微生物学应用技术领域。具体涉及一种苏云金芽胞杆菌增效蛋白
基因的分离、克隆以及它的编码的蛋白在微生物杀虫剂中的应用，本发明还涉及基因工 程菌的制备。与微生物基因工程和生物农药技术领域有关。涉及本发明的生物材料样品即苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)BMB0187
保藏在中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC);保藏单位地址中国湖北省
武汉市武汉大学内；保藏编号CCTCC NO: M208245 ;分类命名苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis)BMB0187。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis ， Bt)是 一 种广泛存在于各种生态环境 中的革兰氏阳性杆状细菌。该物种最大的特点就是在其生长周期中能形成内生芽胞的 休眠体，并且在其芽胞形成的同时能产生对许多昆虫具有特异毒性的由杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins, ICPs)组成的伴胞晶体。这些杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双 翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目等昆虫纲IO个目500多种昆虫以及原生动物、线形动物 门、扁形动物门中某些有害种类也有特异的生物活性(Schnepf H E， Crickmore N， Rie J V， LereclusD， BaumJ， FeitelsonJ， ZeiglerDR， Dean D H. 1998.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev， 62: 775-806)。 由于苏云金芽胞 杆菌对多种昆虫都有很高的杀虫活性，而且具有对环境和人蓄无损害等优点，因此被广 泛地应用于生物农药的开发。目前，基于苏云金芽胞杆菌开发的生物杀虫剂已经成为最 成功的一种生物农药，占到了整个生物农药行业90%以上的市场，广泛地应用于农业、 林业和仓储等害虫的防治。同时人们也不断将苏云金芽胞杆菌的杀虫晶体蛋白基因转入 植物中，构建转基因植物，用于农业害虫的防治。 苏云金芽胞杆菌杀虫剂最初都是使用筛选的野生型菌株进行生产。尽管苏云金 芽胞杆菌有诸多优点，但是在田间应用时也存在防效不稳定、残效期短、杀虫速度慢、 对某些目标害虫不敏感等问题。随着分子生物学的发展，人们逐渐利用基因工程的手段 对野生型菌株进行遗传改造，来提高原有菌株的杀虫活性，延长其残效期等。然而，随 着苏云金芽胞杆菌杀虫剂应用的不断推广和使用强度的不断增强，目标害虫的抗性现象 也不断被科学家所发现。这些因素严重制约了苏云金芽胞杆菌杀虫剂产品的应用和推 广，威胁着整个行业的快速发展。解决这一问题的有效途之一就是寻找新的杀虫增效因 子，用以显著提高原有菌株的杀虫活性，并延缓或克服昆虫对其产生的抗性。
近年来，寻找新的杀虫增效因子一直是苏云金芽胞杆菌应用研究领域中最为活 跃的部分之一。Hilder等利用丝氨酸蛋白酶抑制剂使苏云金芽胞杆菌产生的杀虫晶体蛋 白的杀虫活性提高20倍以上(Hilder VA， Gatehouse AMR， Sheerman SE， Barrer RF， Boulter D.1987.A novel 4 mechanism of insect resistanceengineered into tobacco.Nature 330 : 160-163.) ; Regev等发现几丁质酶(chitinase)可以通过降解昆虫围食膜的几丁质层而大幅提高Bt杀虫晶体蛋白的杀虫活性(Regev A， Keller M， Strizhov N. 1996.Synergistic activity of a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin and a bacterial endochitinase against Spodoptera littoralis larvae.Appl Environ Microbiol 62 : 3581-3586.)。 此后，越来越多的协同增效因 子被发现，如双效菌素ZwittermicinA，伴侣蛋白P20，溶细菌毒素Cyt，钙粘蛋白片段 CR12-MPED等(Pardo-L' opezL， Mu noz-Garay C， Porta H， Rodr' lgguez-Almaz' an C， Sober' on M， Bravo A.2008.Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis.Peptides.In press)。 这些研究结果提供许多策略去提高苏云金芽 胞杆菌菌株的杀虫活性，或者能够很好地延缓或克服昆虫对其产生的抗性，然而对于苏 云金芽胞杆菌杀虫剂产业和基于Bt的转基因植物领域的应用还有相当的距离。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，从苏云金芽胞杆菌中分离并克隆一种 新型的增效蛋白基因，证实了该增效蛋白Bell具有提高杀虫晶体蛋白杀虫活性的功能， 并揭示该增效蛋白(基因)在农业杀虫微生物和转基因微生物或转基因植物中的应用前 景。本发明还涉及苏云金芽胞杆菌基因工程菌的制备及应用。
本发明是这样实现的 申请人:从拥有自主知识产权的苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki， serotype H3ab)YBT-1520(本申请人自己的授权发明专利，中 国发明专利号ZL 95106749.40)菌株中分离得到一个新的增效蛋白基因，申请人将这个 基因命名为bell。经过测序发现该增效蛋白基因bell的编码区由2202个碱基组成，它具 有如序列表SEQIDNO: l所示的核苷酸序列。序列分析发现本发明的bell基因编码的 增效蛋白Bell是由734个氨基酸残基组成，其具有如序列表SEQ ID NO : 1所示的氨基 酸序列，分子量大小约为85kDa。通过原核超量表达和室内生物测定证实本发明的基因 bell在微生物中表达的Bell蛋白，能够显著提高杀鳞翅目昆虫的杀虫晶体蛋白CrylAc的 杀虫活性。申请人通过构建含有增效蛋白Bell的苏云金芽胞杆菌基因工程菌，揭示了该 蛋白在农业害虫棉铃虫的防治方面的具有很好的应用价值。本发明提供的上述基因序列是一种新的增效蛋白基因，该基因可以应用于转化
微生物和植物，使之表达出增效蛋白Bell，使受体生物表现出该蛋白具有的显著提高杀
虫晶体蛋白杀虫活性的特性，可用于克服或延缓害虫对微生物杀虫剂的抗药性问题，在
农业害虫的生物防治方面具有广泛的应用价值。更详细的技术方案参见《具体实施方式
》的描述。
序列表SEQIDNO : l是本发明分离和克隆的苏云金芽胞杆菌增效蛋白基因的核 苷酸序列及编码序列； 图1 :是本发明实施例构建的克隆载体pUC19-be11的构建图； 图2 :是本发明实施例中超量表达载体pEMB0184的构建图； 图3 :是本发明克隆的增效蛋白基因bell的原核超量表达与纯化的SDS-PAGE电
泳分析；
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:蛋白质分子量标准；
BL21/pGEX-6p-l菌株未诱导对照的菌体总蛋白； BL21/pGEX-6p-l菌株l.Ommol/L的IPTG诱导3h的菌体总蛋白； BL21/pEMB0184菌株未诱导的菌体总蛋白； BL21/pEMB0184菌株l.Ommol/L的IPTG诱导3h的菌体总蛋白； 从BL21/pEMB0184诱导培养物中亲和层析纯化的GST-bell蛋白； 从BL21/pGEX-6p-l诱导培养物中亲和层析纯化的GST蛋白。
4 :是本发明实施例中增效蛋白Bell与杀虫晶体蛋白不同浓度配比生物测定
5 :是本发明实施例中增效蛋白Bell与杀虫晶体蛋白不同浓度配比生物测定
6 :含有增效蛋白基因bell穿梭表达载体pBMB0186的构建路线7 :增效蛋白Bell和杀虫晶体蛋白CrylAclO共表达载体pBMB0187的构建
8 :增效蛋白基因bell在苏云金芽胞杆菌BMB171中表达的SDS-PAGE电泳
:蛋白质分子量标准； BMB171菌株36h培养物的菌体总蛋白； BMB0187菌株36h培养物的菌体总蛋白。
具体实施方案 以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对 于本发明只有说明作用，而没有限制作用。有关DNA的标准操作方法和所使用的药品均 参考《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南， 第三版，金冬雁等(译)，北京，科学出版社，2002年)。本发明中所涉及的其他各种实 验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可 以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实 施。 实施例1苏云金芽胞杆菌YBT-1520中增效蛋白基因bell的克隆
本发明以苏云金芽胞杆菌YBT-1520(本申请人自己的授权发明专利，中国发明 专利号ZL95106749.40)作为增效蛋白基因bell的来源菌株，同时可参考文献孙明， 刘子铎，喻子牛.2000.苏云金芽胞杆菌YBT-1520杀虫晶体蛋白基因的属性.微生物学报 40: 365-371。该菌株血清型为H3ab，能形成典型的菱形晶体，主要的晶体蛋白成分的 分子量约为130千道尔顿(kDa)，对鳞翅目昆虫棉铃虫和小菜蛾等具有特异的高毒性。目 前，该菌株的全基因组序列已经由申请人所在课题组测序完成，但没有登录。
1.苏云金芽胞杆菌YBT-1520总DNA的抽提 将苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株用接种环通过无菌操作方法接种于5mL的常用 LB液体培养基中(配方蛋白胨1%，酵母粉0.5%， NaCll%， pH 7.0-7.2)，置于3(TC、 200rpm的摇床中培养过夜；然后通过无菌操作将50 y L的YBT-1520培养物转移至5mL的新鲜LB液体培养基中，同样条件下培养至对数生长期；然后于5000rpm， 3min离心收 集菌体，用STE缓冲液(配方10mM Tris-HCl， pH = 8.0， 50mM NaCl， lmM乙二胺 四乙酸(EDTA))lmL洗涤一次，力B 100 y L溶液I(配方50mM Tris-HCl， pH 8.0， 10mM EDTA)和10 ii L溶菌酶(50mg/mL)， 37。C作用30min以上；加入200 y L2X十二烷基磺 酸钠(SDS)于50°C -60"水浴30min ;加入200 y L 5mol/L NaCl混和，加入500 y L苯酚 /氯仿/异戊醇(按体积比25 : 24 : 1)，离心l加00rpm， 5min，吸取上清液，重复抽 提1-2次；将上层DNA溶液转移至1.5ml离心管，加入等体积95%乙醇，室温静置5min 后离心12000rpm， 5min，取沉淀用200 y L 70%乙醇洗涤一次，冷冻抽干后溶于50 y LTE 溶液中。2.PCR扩增获得bell基因的DNA片段 根据YBT-1520的全基因组中的序列信息，设计了一对特异性引物用来扩增目标 基因bell(引物序列为上游belPl: 5' -GCCGGATCCATGTATACAATGTTTTTCCTC-3'，下游belP2: 5' -GGCGAATTCTTATTCATTATATAAGCTATC-3')。 以事先准备好 的苏云金芽胞杆菌的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应的体系和程序如下
25iiL反应体系包含2.5iiL IOXPCR反应缓冲液，1 y L dNTP(各2.5mM)， 0.5 ii L特异性上游引物Pl(20mM)， 0.5 y L特异性下游引物P2(20mM)， 0.2 y L模板(上 述YBT-1520的总DNA)， 0.25 y L ExTaq酶，加灭菌去离子水至25 y L。
PCR反应参数 和程序为94°C， 5min， 1个循环；94°C， lmin， 52°C， lmin， 72°C， 2.5min， 30个循 环；72°C， 10min， 1个循环。
3.bell基因的序列测定和序列分析 PCR产物通过PCR产物回收试剂盒(购自Omega生物技术公司)纯化回收后通 过T/A克隆连接到T载体pMD19-T上(购自TaKaRa生物技术公司)，得到含有bell全长 基因的重组质粒pUC19-bell(见图1)，之后将该重组质粒转化大肠杆菌E.coli DH5 a ，并 涂布氨苄青霉素抗性平板(Ampr，终浓度为100ug/ml)。将抗性平板置于37。C培养箱中培 养12h-16h，待转化子长到一定大小以后，以belPl和belP2为引物，以转化子的菌落菌体 为模板，通过PCR扩增对转化子进行筛选。将筛选到的阳性转化子用5ml的液体LB培 养基活化培养，然后取lml的过夜培养物送样测序(由Invitrogen公司完成)。测序结果 具有如序列表SEQIDNO: l中所示的核苷酸序列，申请人将该基因命名为bell基因(基 因命名以斜体小写表示)。通过软件分析预测此段编码序列可编码一个由734个氨基酸组 成的蛋白质，预测其分子量为85kDa，申请人将其命名为增效蛋白Bell(蛋白命名以正体 大写表示)。 实施例2苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bell的超量表达，纯化和增效活性
1.苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bell原核超量表达载体的构建
将实施例1中获得的含有bell全长基因的重组质粒pUC19-be11经BamHI和 EcoRI双酶切，同时将表达载体pGEX-6p-l进行相同的双酶切。上述载体和外源的酶切 产物通过0.8 %的琼脂糖凝胶分离后，切下目标片段并通过DNA凝胶回收试剂盒(购自 Omega生物技术公司)纯化回收。之后将两者通过T4连接酶(购自宝生物工程(大连)有 限公司，即TaKaRa)连接，从而获得了含有bell全长ORF的重组表达质粒pEMB0184(见 图2)。将该重组表达质粒转化大肠杆菌E.coli DH5 a (购自Tiangen公司)，并抽提质粒
6分别进行BamHI和EcoRI双酶切验证，酶切片段大小与预期大小一致，进一步的测序结 果表明bell全长ORF片段被正确地插入了到了表达载体pGEX-6p-l中。
2.苏云金芽胞杆菌增效蛋白Bell原核超量表达，纯化与定量分析
为了得到大量的增效蛋白Bell，申请人将上述携带有增效蛋白bell全长编码基 因的重组表达质粒pEMB0184转化到大肠杆菌BL21(DE3)(购自Tiangen公司)，得到了重 组菌BL21/pEMB0184。将该重组菌株接种于5mL LB液体培养基中(另外附加终浓度为 100 ii g/mL氨苄青霉素)，过夜活化。以1 : 100(体积比)转接至50mLLB液体培养基 中，置于37t:摇床培养至OD600为0.5-0.8左右以后，加入l.Ommol/L的异丙基-B-D-硫 代半乳糖苷(即IPTG，购自sigma公司)于37 tH秀导培养3h。 之后12000rpm离心 30sec收集菌体，分别用0.5XNaCl和灭菌去离子水洗涤菌体三遍后，按照菌体灭菌去 离子水=1 : 5的体积比重新混匀菌体，加入等体积的2X上样缓冲液(2X上样缓冲液 配方100mm/l Tris-Cl(pH6.8)， 200mm/L 二硫苏糖醇，4%SDS， 0.2%溴酚蓝，20%甘 油)，混匀后，沸水浴中处理3-5min， 12000rpm离心5min，以上清液进行SDS-PAGE电 泳。SDS-PAGE电泳操作步骤参见Laemmli描述的方法(Laemmli， UK. 1970.Cleavage of structural proteins duringthe assembly of the head ofbacteriophage T4.Nature 227 : 680-685)。 结果如图3所示，与空载体对照菌株BL21/pGEX-6P-l相比，本实施例的BL21/pEMB0184 表达了一条特异蛋白带，如图3泳道4所示。与蛋白分子量标准比对，估算该特异性蛋 白其分子量为113kDa，与预计的融合增效蛋白GST-Bell分子量大小吻合。证明本发明 的增效蛋白Bell在大肠杆菌中得到了成功的表达。 将上述重组菌BL21/pEMB0184的3h诱导培养物经过12000rpm离心30sec收集菌 体，利用超声波(技术参数功率400W，破碎30秒，间歇30秒)将细胞破碎后12000rpm 离心15min取上清。然后将上清液过亲和层析柱(购自Novagen公司)提纯该特异蛋白 GST-Bell。具体的纯化步骤按照试剂盒GST Bind (购自Novagen公司)操作说明书进 行。对最终的纯化产物进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3泳道5所示，提纯的蛋白 与BL21/pEMB0184中表达的特异性蛋白条带大小一致(如图3泳道4所示)，说明本发 明提纯的特异蛋白就是融合增效蛋白GST-Bell。之后，用Bradford染色法(具体方法参 考文献Bradford M M.1976.A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteinutilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem 72 : 248-254.) 测定了纯化的蛋白溶液的含量，结果表明纯化的增效蛋白溶液浓度为98.86 g/mL。
3.杀虫晶体蛋白CrylAclO的提纯和定量分析 将携带杀虫晶体蛋白基因crylAclO的苏云金芽胞杆菌重组菌BMB871(菌株来源 见文献吴岚，孙明，喻子牛，利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含crylAclO基 因的解离载体，微生物学报，2000， 40: 264-269.)菌株在ICPM培养基(配方蛋白胨 0.6%，葡萄糖0.5%， CaCO30.1%， MgSO40.05%， KH2PO40.05%， pH7.0-7.2)中培养 48h-52h后，取发酵液按照常规的复红染色制作镜片，经光学显微镜观察，待90%以上的 芽孢脱落后，将发酵液于12000rpm， 4t:离心10min收集胞晶混合物，之后分别用lmo1/ mL NaCl和蒸馏水洗三遍，然后加入适量50mmol/mLNa2CO3(3 % P -巯基乙醇，pH = 9.5)，充分混匀，37。C水浴60min， 12000rpm， 4。C离心15min去沉淀，上清中加入二十 分之一体积的4mol/mL NaAC-HAc(pH4.0)，冰上静置30min ; 12000rpm， 4。C冷冻离心
710min，收集沉淀物，用去离子水清洗3遍，最后将沉淀溶于50mmol/mL Na2C03(pH9.5)
中，即为提纯后杀虫晶体蛋白溶液。 同样地用Bradford染色法测定了纯化的杀虫晶体蛋白CrylAclO蛋白溶液的含
量，结果表明本发明纯化的CrylAclO蛋白溶液浓度为748.1 y g/mL。4.增效蛋白Bell对杀虫晶体蛋白CrylAclO杀虫的增效活性的测定 以棉铃虫(Helicoverpa armigera)初孵幼虫为对象测定了本发明制备的增效蛋白
Bell对杀虫晶体蛋白CrylACIO杀虫的增效活性。具体的生物测定程序按照标准测定程
序(参见文献沈鞠群等.苏云金杆菌制剂的标准化程序和方法，生物防治通报，1990(增
刊)12-16)进行。每个样品的生物测定重复3次，并计算出LCs。。 为了检测增效蛋白Bell对杀虫晶体蛋白CrylAclO杀虫的增效活性，申请人设计
了下列两个实验。 在第一个实验中申请人首先固定了杀虫晶体蛋白的CrylAclO在饲料中的最终使 用浓度为3 g/mL，将不同浓度的的增效蛋白Bell溶液与之混合后加入到饲料中进行生 测。共设置了5个浓度梯度，增效蛋白Bell与杀虫晶体蛋白CrylAclO的比例分别为(质 量比)O :15， 1 ; 15 ; 2 : 15， 4 : 15， 8 : 15，设单独的CrylAclO也即0 : 15组为对 照。结果如图4所示，对照组中单加3 iig/mL的CrylAclO可以引起的死亡率为34.2%， 而当加入了 0.2的y g/ml增效蛋白Bell后，其致死率急剧上升到了 65.3%。当增效蛋 白Bell的浓度继续增加以后，死亡率也跟着上升到了76.2%。以上结果说明该增效蛋白 有明显的增强杀虫晶体蛋白CrylAclO杀虫毒性的作用，而且在该增效效果随着增效蛋白 Bell浓度的增加而提高。在第二个试验中申请人固定了增效蛋白Bell在饲料中的最终使用浓度为0.2y g/ mL，将不同浓度的的杀虫晶体蛋白CrylAclO溶液与之混合后加入到饲料中进行生测。 共设置了 4个浓度梯度，增效蛋白Bell与杀虫晶体蛋白CrylAclO的比例(按质量比计) 分别为l :0， 1; 15; 1 : 30， 1 : 60，设单加CrylAclO组为对照。结果如图5所示， 我们可以明显看出，在所用的4个浓度比例下，增效蛋白Bell与CrylACIO混合使用组的 供试昆虫的死亡率明显高于没有添加增效蛋白的CrylAclO各浓度组的死亡率。以上结果 进一步说明该增效蛋白具有明显的增强杀虫晶体蛋白CrylAclO杀虫毒性的作用。
实施例3利用增效蛋白Bell构建苏云金芽胞杆菌高效杀虫基因工程菌
在实施例2中申请人证明了体外纯化的增效蛋白Bell具有明显的增强杀虫晶体 蛋白CrylAclO杀虫毒性的作用，本实施例利用了该蛋白的这一特性，构建出了一株高效 杀虫的苏云金芽胞杆菌基因重组菌。具体制备步骤如下
1.含增效蛋白Bell的大肠杆菌-苏云金芽胞杆菌穿梭表达载体的构建
为了让增效蛋白基因bell能够在苏云金芽胞杆菌中表达，申请人采用重叠延伸 的方法(即SOE法，具体方法和原理可以参考J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验 指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)在其编码区的起始密码子前加上了 该基因自身的启动子。构建路线如图6所示，由于片段太长，采取了分段扩增的办法对 启动子和基因的编码区进行连接。首先根据YBT-1520基因组上基因bell上游启动子序 歹'J设计一对弓I物，pi : 5' -TGCGGATCCCGTTAAGTTTCTC-3' ， p2 : 5' -AACAAGT AACCTTTTCATAAGTTACCTCCATCTCTT-3'。再根据重组质粒pUC19-bell上基因bell的序列，设计另一对引物，p3:5' -CTGTGGTAAGTTATTATCGCCGTACGCGC-3'; p4: 5' -GGATCAACTAGAGCTCTTGC-3'。 以以本发明的来源菌株苏云金芽胞杆菌 YBT-1520的总DNA为模板，用本实施例设计的引物pl和p2扩增出了基因bell的启动 子900bp左右的片段，该片段3'端带有基因bell基因编码区的第1-20个碱基；以质粒 pUC19-bdl的DNA为模板，用引物p3和p4扩增出了基因bell的编码区片段的1-1400个 碱基的区域bell-l，该片段5'端带有bell的启动子片段末端的20个碱基。纯化两个扩 增产物后，将两个DNA片段混在一起作为模板，用引物pl和p4进行第2轮PCR扩增， 扩增得到了大约为2.2kb左右的片段，即为基因pro-bell-l。最后经过测序证明启动子pro 与基因bell基因的bell-l部分编码区连接正确。 将得到的pro-bell-l基因片段经BamHI和Sacl酶切后，插入到大肠杆菌-苏云 金芽胞杆菌穿梭载体pHT304(载体来源见Arantes 0 and Lereclus D. 1991.Construction ofcloning vectors for Bacillus thuringiensis.Gene 108 : 115-119)相应的多克隆位点中，获
得了重组质粒，申请人将该重组质粒命名为pBMB0185，经酶切验证与预计片段大小相 符。
为了获得完整的bell基因，用设计的另 一 对特异性引物p5 : 5， -GCAAGAGCTCTAGTTGATCC-3，禾口 p6 : 5' -CTGCCGAATTCTGAGAAGGT-3 ，， 以pUC 19-bel 1的DNA为模板，扩增出了 bel 1基因剩余的800bp左右的片段bel 1 -2 。 然 后经SacI和EcoRI酶切后，插入到pBMB0185相应的多克隆位点中，从而获得了包含bell 基因完整的启动子和编码区的穿梭表达质粒pBMB0186，经酶切验证与预计片段大小相 符。 2.增效蛋白Bell和杀虫晶体蛋白CrylAclO共表达载体的构建
为了利用增效蛋白Bell具有增强杀虫晶体蛋白CrylAclO杀虫毒性的特性，申请 人将增效蛋白Bell和杀虫晶体蛋白CrylAclO在苏云金芽胞杆菌BMB171(菌株来源见文 献李林，杨超，刘子铎，李阜隶，喻子牛.2000.苏云金芽孢杆菌无晶体突变株的逐级 升温筛选及其转化性能.微生物学报5 : 395-399.)中进行共表达。共表达载体的构建如图 7所示。即，用Sphl单酶切从质粒pBMBBK-304(质粒来源见文献孙明，吴岚，刘子 铎，喻子牛.2000.利用苏云金芽胞杆菌非芽胞特异性的启动子表达crylAclO和crylC基 因.农业生物技术学报8 : 229-232.)中将完整的杀虫晶体蛋白基因crylAclO的启动子和编 码区切下来，并插入到包含bell基因完整的启动子和编码区的穿梭表达质粒pBMB00186 的Sphl位点，得到了同时含有bell基因和crylAclO基因的表达质粒，经酶切验证证明酶 切产物与预计片段大小相符，说明构建正确，申请人将该重组质粒命名为pBMB0187。
3.增效蛋白基因bell在苏云金芽胞杆菌BMB171中的表达 为了检测增效蛋白基因bell是否能够在BMB171中正常表达，通过电转化的方 法(吴岚，孙明，喻子牛.利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含crylAclO基因的解 离载体.微生物学报，2000， 40: 264-269.)将上述构建的共表达重组质粒pBMB0187转化 到苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171中。通过抗性筛选和酶切验证得到了正确的转 化子BMB0187。 将上述重组菌BMB0187在LB培养基(使用时加入终浓度为20 ii g/mL的红霉 素)中过夜活化后，转移至ICPM培养基(使用时附加终浓度为20 ii g/mL的红霉素)中，培养至芽胞完全成熟脱落，收集菌体，分别用0.5XNaCl和灭菌去离子水洗涤三遍后， 按照菌体灭菌去离子水=1 : 5的体积比重新混匀菌体，加入等体积的2倍上样缓冲液 (配方同本说明书前面的描述)，混匀后，沸水浴中处理3-5min， 12000rpm离心5min，以 上清液进行SDS-PAGE电泳。其结果如图8所示，苏云金芽胞杆菌BMB0187能表达出 和预计大小相同的特异性的蛋白质，与分子量标准对比，预测其分子量大小为85kDa， 而阴性对照的苏云金芽胞杆菌BMB171中(只含有穿梭载体pHT304)则无此对应条带， 说明增效蛋白基因bell在苏云金芽胞杆菌BMB171中得到了表达。另外通过电子显微镜 观察证明该重组菌能够很好地形成典型的菱形晶体，说明增效蛋白基因bell在苏云金芽 胞杆菌BMB171中的表达并不影响杀虫晶体蛋白CrylAclO的正常表达。以上结果证明 成功获得了同时表达增效蛋白Bell和杀虫晶体蛋白CrylAclO的基因工程菌，申请人将 其命名为BMB0187。申请人:制备的基因工程菌为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) BMB0187，于2008年12月4日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO: M208245。
基因工程菌BMB0187的生物学及遗传学特性 ①生物学特性菌体直杆状，营养体呈链状或单生，长3-5微米，宽1-1.2微
米，革兰氏染色阳性，芽胞呈圆柱状或近椭圆，偏端生，芽胞囊不膨大，在牛肉膏 蛋白胨培养基上菌落圆形，边缘平滑，菌苔丰满呈蜡质状，生长温度10-45t:，最适 pH6.8-7.4，兼性嫌氧，在含7XNaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长，在核糖、葡萄糖、 果糖、麦芽糖和可溶性淀粉培养基中产酸，甲基红反应阳性，芽胞生长后期产生伴胞晶 体，伴胞晶体呈菱形，大小不一。 ②本发明是以苏云金芽胞杆菌无质粒突变菌株BMB171为出发菌株得到的基 因工程菌，其鞭毛抗原血清型为H2，含有杀虫晶体蛋白基因crylAclO和增效蛋白基因 bell，伴胞晶体由130KDa晶体蛋白组成。经继代培养，辅助基因bell能够在工程菌中 稳定存在，表达正常，对受体菌的生长无重大影响。 4.含bell基因的苏云金芽胞杆菌BMB0187对棉铃虫杀虫活性的室内生物测定
为了检测本发明构建的含bell基因的苏云金芽胞杆菌BMB0187的杀虫活性，以 棉铃虫H.armigera初孵幼虫为对象测定了该工程及其出发菌株的的杀虫效果。将本发明 制备的菌株BMB0187和只含有CrylAclO的重组菌BMB871在常用的LB液体培养基(使 用时加入终浓度为20ii g/mL的红霉素)中过夜活化后，然后按照体积比为1 : 100的接 种量转移至30ml的ICPM培养基(使用时加入终浓度为20 y g/mL的红霉素)中，培养至 芽胞即将成熟脱落的阶段，收集菌体，用灭菌去离子水洗涤一遍后，获得伴胞晶体混合 物，按照标准测定程序(见沈鞠群等，苏云金杆菌制剂的标准化程序和方法，生物防治 通报，1990，(增刊)12-16)进行生物测定。每个样品的生物测定重复3次，并通过专 业统计软件DPS(参考文献唐启义，冯明光.DPS数据处理系统。北京中国农业出版 社.1997)计算出LCs。。结果如表l所示，从表l中对应浓度的死亡率和计算出的LQ。可 以看出，导入了bell基因的重组菌BMB0187对棉铃虫的杀虫毒力明显比未导入bell基因 的出发菌株BMB871强，而且相对增效倍速达到了 5.7倍。 表1含bell基因的重组菌BMB0187与对照菌株BMB871对棉铃虫的杀虫活性
10菡洙名称基B型增效倍数
BMB8710.51
BMB0i87 上述结果说明本发明制备的苏云金芽胞杆菌BMB0187的杀虫活性比只含有 CrylAclO的出发菌株BMB871的杀虫活性提高了近5倍。本发明的应用前景显示，利用 本发明的菌剂防治棉铃虫，在达到相同杀虫效果的同时可以大大减少Bt农药的使用量， 从而可以节约大量的生产成本。另外，由于Bell蛋白本身来自于苏云金芽胞杆菌，不存 在转基因生物安全问题，展示本发明的bell基因在苏云金芽胞杆菌基因工程菌构建方面 具有良好的应用价值。
序列表
<110>华中农业大学 <120>苏云金芽胞杆菌增效蛋白基因bell的克隆与工程菌制备及应用 <130> <141>2008-12-01 <160>2<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2202
<212>DNA<213>苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis) <220> <221>gene <222>(1)..(2202) <223> <220> <221>CDS <222>(1)..(2202) <223> <400>1atg tat aca atg ttt ttc etc ata gga aat ata cac tta cat get gat 48
Met Tyr Thr Met Phe Phe Leu lie Gly Asn lie His Leu His Ala Asp
15 10 15gaa cga ata aat gca aaa aaa att act agt tta gaa gag cct act tgg 96
Glu Arg lie Asn Ala Lys Lys lie Thr Ser Leu Glu Glu Pro Thr Trp
20 25 30ata ttt cag gcg ggc ata agt aag ggg aaa tat cat gac cga caa gat 144
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35 40 45tta gga ttt att ttg aag aga aat aca cca tta aag gta aga caa aca 192
11
Leu Gly Phe lie Leu Lys Arg Asn Thr Pro Leu Lys Val Arg Gin Thr 50 55 60 aat cct aat ttt aaa gac aaa tta aca tta cgt tta ttg tct aat gac 240 Asn Pro Asn Phe Lys Asp Lys Leu Thr Leu Arg Leu Leu Ser Asn Asp 65 70 75 80 tea aaa aat gaa aaa tec ata caa gta gga aat gaa tgg gtt act ate 288 Ser Lys Asn Glu Lys Ser lie Gin Val Gly Asn Glu Trp Val Thr lie 85 90 95 caa ggt gat acg tct tta gtt cct ttc ata gat act ccg tat ggt gaa 336 Gin Gly Asp Thr Ser Leu Val Pro Phe lie Asp Thr Pro Tyr Gly Glu 100 105 110 gag cac get gta ctt gag tac caa gta ggg aat gaa agt get act aac 384 Glu His Ala Val Leu Glu Tyr Gin Val Gly Asn Glu Ser Ala Thr Asn 115 120 125 ccc ctt ccc att tat aaa caa caa gga agt gta tct caa ttt ttt agt 432 Pro Leu Pro lie Tyr Lys Gin Gin Gly Ser Val Ser Gin Phe Phe Ser 130 135 140 aca tgg gat caa ttt gat gga gag tat gcg tta ctt caa ggg gag agt 480 Thr Trp Asp Gin Phe Asp Gly Glu Tyr Ala Leu Leu Gin Gly Glu Ser 145 150155 160 ttt caa tta ttt gta cct aaa aaa gat aaa gag tta gta aga tct tta 528 Phe Gin Leu Phe Val Pro Lys Lys Asp Lys Glu Leu Val Arg Ser Leu 165 170 175 aaa gat ttt caa tea ttg gat gag tta att gcg tat tat gaa gat att 576 Lys Asp Phe Gin Ser Leu Asp Glu Leu lie Ala Tyr Tyr Glu Asp lie 180185 190 ttt gtg atg tat gat tea att att ggt tta gat ggc tea acg ttt gaa 624 Phe Val Met Tyr Asp Ser lie lie Gly Leu Asp Gly Ser Thr Phe Glu 195 200 205 aat aaa aaa agt caa aat cgt tat ttc tta aaa gca gat ata tct ggt 672 Asn Lys Lys Ser Gin Asn Arg Tyr Phe Leu Lys Ala Asp lie Ser Gly 210 215 220 get ggc ggt gcc tat tat ggc aca aat tgg aca gcg aat agt aca gat 720 Ala Gly Gly Ala Tyr Tyr Gly Thr Asn Trp Thr Ala Asn Ser Thr Asp 225 230 235 240 agt aca aag atg tgg tta gat aaa eta agt tgg gga act tta cat gaa 768 Ser Thr Lys Met Trp Leu Asp Lys Leu Ser Trp Gly Thr Leu His Glu 245 250 255 ate get cat gga tac caa get ggt ttt gat aat caa gga ata ttt aca 816
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355 360 365 tct tta cca gat tta atg aat cag tat tat agt gag aat gga caa gtt 1152 Ser Leu Pro Asp Leu Met Asn Gin Tyr Tyr Ser Glu Asn Gly Gin Val
370 375 380 gat ttt aca cct gtt ttt gaa aga tgg ggc ttt aag ctt aat cat aaa 1200 Asp Phe Thr Pro Val Phe Glu Arg Trp Gly Phe Lys Leu Asn His Lys 385 390 395 400 caa ata gag atg aat agg gcg aaa ggt ttt ccg get gtt act tct tta 1248 Gin lie Glu Met Asn Arg Ala Lys Gly Phe Pro Ala Val Thr Ser Leu 405 410 415 get tat ata gtg cct gaa tea caa tta gcg aaa gca aga get ata gtt 1296 Ala Tyr lie Val Pro Glu Ser Gin Leu Ala Lys Ala Arg Ala lie Val
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435 440 445 caa att get cca ctt ggg eta aaa ggg aat ttg cat ate cat tta aat 1392 Gin lie Ala Pro Leu Gly Leu Lys Gly Asn Leu His lie His Leu Asn
450 455 460 aca aat gaa ata gat aca tta aaa gga gga aaa att aaa tta aaa gaa 1440:0181 ] Thr Asn Glu lie Asp Thr Leu Lys Gly Gly Lys lie Lys Leu Lys Glu
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14
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15
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16
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权利要求
一种分离克隆的苏云金芽胞杆菌增效蛋白bel1基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO1所示。
2. —种分离克隆的苏云金芽胞杆菌增效蛋白Belli的编码基因，它的氨基酸序列如序 列表SEQIDNO : 1所示。
3. —株重组苏云金芽胞杆菌增效蛋白bell基因的工程菌，该工程菌是苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis)BMB0187，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号 为CCTCCNO : M208245。
4. 权利要求2所述的编码基因作为蛋白在制备微生物杀虫剂中的应用。
5. 权利要求2所述的编码基因作为蛋白在转基因微生物或转基因植物中的应用。
6. 权利要求3所述的工程菌BMB0187在制备微生物杀虫剂中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物基因工程技术领域。公开了一种来自于苏云金芽胞杆菌的增效蛋白基因bel1的分离、克隆及增效蛋白Bel1在生物杀虫剂中的应用。从苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520菌株中分离得到一个新的增效蛋白基因bel1，该基因编码产物为一种新的增效蛋白Bel1；该蛋白对鳞翅目昆虫的杀虫晶体蛋白Cry1Ac具有很强的杀虫增效活性；本发明制备的重组蛋白的杀虫活性是出发菌株杀虫蛋白活性的5.7倍。本发明还包括重组苏云金芽胞杆菌增效蛋白bel1基因工程菌的制备，该工程菌已保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NOM208245。
文档编号C12N15/31GK101691572SQ200810236718
公开日2010年4月7日 申请日期2008年12月9日 优先权日2008年12月9日
发明者喻子牛, 孙明, 彭东海, 方尚玲, 罗春平, 阮丽芳, 陈守文 申请人:华中农业大学