苏云金芽胞杆菌ybt1520中的杀线虫蛋白nel的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物应用技术领域。具体设及一种苏云金芽胞杆菌度acillus thu;ringiensis)YBT1520的杀线虫蛋白基因的克隆、异源表达及对根结线虫的生物测定，本 发明的蛋白可用于微生物农药的制备和开发W及转基因植物的应用。
【背景技术】
[0002] 苏云金芽胞杆菌度acillus thuringiensis)是一类广泛存在于±壤中的革兰氏 阳性细菌，它的一个显著特点就是能够在芽胞期产生对昆虫具有特异毒杀作用的晶体蛋白 (Insecticidal C巧Stal Proteins, ICPs)。近年来，苏云金芽胞杆菌毒杀线虫的能力被人 们广泛关注。目前，化巧，化y6,化yl3,化yl4,化y21和化y55类晶体蛋白被报道对线虫具 有活性，芽胞杆菌中的几下质酶，金属蛋白酶也被报道有线虫毒杀活性。
[0003] 植物寄生线虫病是一种世界范围内普遍发生的由植物寄生线虫所引起的植物病 害。据估计，植物寄生线虫造成全球主要农作物的年损失率约为12. 3%，每年直接经济损 失超过1000亿美元，在整个农业害虫造成的损失里几乎占到了一半，是排在全球气候变化 和生态环境恶化之后的第=大农业影响因素（段玉蜜，吴刚.植物线虫病害防治.北京： 中国农业科技出版社.2002.)。根结线虫是植物寄生线虫中的一种，是植物根系定居性内 寄生生物，是我国经济作物的重要病原线虫，其寄主植物超过3000种，分属于114科，其 中W茄科、葫芦科、十字花科等植物受害尤为严重（汪来发等.根结线虫生物防治研究进 展.南京林业大学学报（自然科学版），2002, 26(1) :64-68.)。目前用于防治根基线虫的方 法有：植物检疫、农业防治、化学防治、生物防治。植物检疫是一种可W根治线虫的好方法， 但其成本高，不适宜大规模推广；农业防治技术在理论上来说非常有效，但是在实际生产中 存在严重的弊端；化学杀虫剂对环境污染严重，使用过程中对人畜不安全，许多杀虫剂已被 禁用（刘维志，植物病原线虫学，北京：中国农业出版社，2000)。而与W上方法相比， 生物防治由于具有稳定、经济、长效和相对安全的特点，同时还能除害增产、减轻污染、保护 生态环境，逐渐受到广泛关注。上世纪80年代Bone等人通过研究首次证实了苏云金芽胞 杆菌晶体蛋白对线虫有杀虫活性度oneLW,BottjerKP，GillSS.Trichostrongylus colubriformis:EggIeth曰IityduetoBscillusthuringiensiscryst曰Itoxin.Exp. Parasitol.，1985, 60:314-322.)。之后，美国Mycogen公司的大量研究工作也进一步证 实了苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对线虫的作用度ra壯ishGA(1992).P;rocess化r controllingIepidopteranpests.EP19920920639.)。
[0004] 苏云金芽胞杆菌YBT1520是由申请人所在的农业微生物学国家重点实验室保存 的野生型菌株。肥L是在YBT-1520的基因忍片结果中发现的，存在于YBT-1520某质粒 上，具有NPPl和化CinB结构域的新型杀虫蛋白。近年来，在植物病原菌中发现一类能引 起植物细胞死亡的蛋白家族，运类蛋白都含有一个保守结构域NPPl(necrosis-imlucing Phyto地thoraprotein)，它们被统称为NLPs(化pl-l;Lkeproteins)。很多NLPs的一个 共同的功能特征是触发很多双子叶植物产生防御反应、坏痘、萎黨和细胞坏死，但是单子叶 植物对其不敏感（MarkGijzen,Thorsten伽rnber邑er.NEL-likeproteinsfromplant pathogens:RecruitmentanddiversificationoftheNPPldomainacrosstaxa.Phyt ochemistry，2006, 67:1800-1807.)。Ricin是一种分子量为65kd的由S条寡糖链糖构成的 蛋白，主要结构是由两条肤链（A/B链）组成的异二聚体（戎隆富，王新建等.藍麻毒素研 究进展，安徽预防医学杂志，1999,5(2).)。Ricin具非常强的毒力和细胞毒性作用。Ricin B链上的半乳糖结合位点与细胞表面含末端半乳糖残基的受体结合；使整个毒素分子W内 吞方式进入细胞；形成囊泡；毒素通过囊泡进入细胞质；随后蛋白链间二硫键被裂解；游离 出A链。A链是一种蛋白酶；作用于真核细胞核糖体60S大亚单位的28SrRNA;水解A4324 位点的腺嚷岭N-糖巧键；使其脱去腺嚷岭；丧失抗RNA酶的抗性而被降解；不能与延长因 子巧F-2)结合，从而抑制蛋白质合成；最终导致细胞死亡。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于从野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520中克隆并表达了一个新型 的杀线虫晶体蛋白基因nel，生物测定实验表明该蛋白对线虫具有高毒力，预示着该基因在 防治根结线虫杀虫制剂及转基因抗虫作物等研究领域有着良好的应用前景。
[0006] 具体地本发明设及一种苏云金芽胞杆菌度acillus thuringiensis) YBT1520的杀 线虫蛋白基因的克隆、异源表达及对根结线虫的生物测定，本发明的蛋白可用于微生物农 药的制备和开发W及转基因植物的应用。
[0007] 实现本发明的技术方案如下所述：
[0008] 申请人从野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520的基因组信息中分析并克隆到一个新 的杀虫晶体蛋白基因nel(详细信息请参见《【具体实施方式】》）。经过进一步测序发现本发 明的nel其编码区由1554个碱基组成，其核巧酸序列如SEQIDN0:1所示。经序列分析发 现，nel编码的蛋白肥L由518个氨基酸组成，其蛋白质的序列如SEQIDN0:2所示，预测 分子大小为52kDa。通过构建大肠杆菌重组菌纯化肥L蛋白及生物测定实验证明肥L蛋白 对根结线虫具有毒杀作用。 W09] 申请人将获得的包含有杀虫晶体蛋白基因nel重组的大肠杆菌命名为EscherichiacoliBL(祀T28a-nel)，于2014年7月7日送交中国.武汉.武汉大学中国 典型培养物保藏中屯、保藏，保藏号为CCTCCNO:M2014326。
[0010] 本发明提供的上述基因序列是一种新的杀线虫蛋白基因，该基因在防治根结线虫 杀虫制剂及转基因抗虫作物等研究领域具有广泛的应用价值。
[0011] 更详细的实施方案参见实施例中的描述。
【附图说明】
[0012] 序列表SEQIDNO: 1是本发明分离克隆的苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白基因的核巧 酸序列及其编码的蛋白质的序列。
[0013] 序列表SEQIDN0:2是本发明分离克隆的苏云金芽胞杆菌杀线虫蛋白的蛋白质的 序列。
[0014] 图1:是本发明实施例中杀虫蛋白基因nel的技术流程。
[0015] 图2:是本发明实施例中克隆载体祀T28a-nel的构建图及其物理图谱。
[0016] 图3 :是本发明实施例中克隆载体祀T28a-nel的DNA凝胶电泳图。
[0017] 图4:是本发明实施例中杀线虫蛋白肥L在重组菌中表达纯化的SDS-PAGE电泳分 析结果，图中：箭头1所指是纯化后的肥L蛋白，箭头2所指是纯化前的肥L。
[0018] 图5:是本发明实施例中杀线虫蛋白肥L针对根结线虫的生物测定结果图。
【具体实施方式】
[0019]W下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于 本发明只有说明作用，没有限制作用。有关实施例中所提到的DNA的标准操作方法和所 使用的试剂均可参见《分子克隆实验指南》中所描述的方法（参见萨姆布鲁克和拉塞尔， 2001，分子克隆实验指南，第=版，金冬雁等（译），科学出版社，北京）。本发明中所设及的 其他各项实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术 人员可W参照本发明申请日前的各种常用工具书、科技文献或相关说明书、手册等加W实 施。
[0020] 实施例1苏云金芽胞杆菌YBT1520中杀虫晶体蛋白基因nel的克隆
[0021] 本发明W野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520(该野生型苏云金芽胞杆菌度acillus thuringiensis) 1520的专利号为化95106749. 4)作为杀线虫蛋白基因nel的来源菌株。
[0022] (1)苏云金芽胞杆菌YBT1520总DNA的抽提
[0023] 采用常用的碱裂解法小量提取。其步骤如下：
[0024] 将野生型苏云金芽胞杆菌YBT1520于28°C摇床中进行过夜活化，按l/100(v/v)的 接种量转接至7mL新鲜的LB液体培养基中，于28°CW1200化/min震荡培养至对数生长中 期；将培养好的YBT1520菌液分装至1. 5mL离屯、管内，收集菌体（120(K)r/min，Imin)，并用 STE溶液（IOmMTris?肥1 [抑8. 0]，ImMEDTA[抑8. 0]，IOOmMNaCl)洗涂 1 次；将上述菌体 悬于100^1溶液