1(501111薦糖，251111化13.肥1[9册.0]，101111邸14[9册.0])，加入20^1 溶菌酶（50mg/血）混匀，冰上静置2~化或过夜；加200yL2 %十二烷基硫酸钢（SD巧溶 液，轻缓混匀后于55°C干浴锅处理30min;加100yL5M化Cl溶液，轻缓混匀后至于冰上， 静置IOmin;W1200化/min离屯、5min，吸取上清液至一个新的离屯、管中，分别加入RNase和 蛋白酶K至终浓度10Jig/mL和10Jig/mL，混合均匀后至于37°C水浴锅溫浴30min;用苯酪 /氯仿/异戊醇溶液（体积比为24:25:1，v/v/v)抽提2次；吸取上清，并加入2倍体积的 无水乙醇或等体积的异丙醇，于室溫静置30min或-20°C静置化后，W120(K)r/min4°C离 屯、5min，弃上清，用70%乙醇洗涂沉淀1次；常溫干燥沉淀，用20~30yLTE溶液（IOmM Tris?肥1 [P册.0]，ImM邸TA[P册.0])溶解沉淀，即为制备的总DNA样品。
[0025] 似苏云金芽胞杆菌YBT1520中杀虫蛋白基因nel的克隆
[00%] 根据苏云金芽胞杆菌YBT1520基因组信息及生物信息学预测结果设计一对特异 性引物，该引物对的DNA序列如下所示：
[0027] GCGGAATTCATGAAATTAATATCAAAAATAGT/ATAAAGCTTATAAGCACCGCCATCTTCC，W苏云 金芽胞杆菌YBT1520总DNA为模板进行PCR扩增W获得目标基因，PCR反应的体系和程序 如下： 阳02引 20yL反应体系包括：2yLIOXPCR反应缓冲液，1. 6yLdNTP，各0. 5yL特异性 引物，0. 2yL模板，0. 2yLEx-taq酶，加去离子水补充至20yL。
[0029] PCR反应程序和参数为：94°C，5min，I个循环；94°C，30s，52°C，30s，72°C，3. 5min， 30 个循环；72°C，lOmin，I个循环；24°C，5min，I个循环。
[0030] 将上述扩增得到的目标片段通过PCR回收试剂盒（购自Omega公司产品）纯 化回收后，酶切回收后连接到载体祀T28a上，即得到含有杀虫蛋白基因nel的重组载体 祀T28a-nel(见图2)。将上述连接产物转化大肠杆菌化21，对得到的重组子进行抽质粒及 酶切验证，将验证正确的重组子送样测序（测序工作由北京奥科生物技术有限公司完成）。 测序结果显示上述扩增得到的目标片段含有如序列表SEQIDNO:1中所示的核巧酸序列， 申请人将该基因命名为nel(在本发明中，被命名的基因W斜体小写字母表示）。通过生物 学软件分析发现，该基因可编码一段如序列表SEQIDNO:1中所示的核巧酸序列和对应的 氨基酸序列，预测其分子量为52kDa，申请人将其命名为NEL(本发明中，被命名的蛋白W正 体大写字母表示）。
[0031] 实施例2杀线虫蛋白基因nel在重组菌株E. coil BL(祀T28a-nel)中的表达纯化 及生物活性测定
[0032] (1)杀线虫蛋白肥L的表达及纯化
[0033] 37°C过夜活化E.COilBL(祀T28a-nel)菌株，按1/100的接种量转接至新鲜的LB 培养液中，于37°CW22化/min振荡培养到对数生长中期，按1/1000的量加入0.IMIPTG， 于16°CW200;r/min振荡诱导5小时，在12000;r/min，Imin, 4oC离屯、收集菌体，加6-lOml Bindingbuffer洗涂菌体2次，适当体积BindingBuffer重悬，准备高压破碎（W下操作均 在冰上进行）；高压破碎4-5次后，用1. 5ml的EP管取样Iml离屯、，4oC，12000r/min，30min 离屯、收集上清；将收集的上清用0. 45um的微孔滤膜过滤；将膜放入柱底，加适当体积水，用 枪从膜上部吸取气泡，待气泡不再产生，再吸走膜底部的气泡，W免气泡影响流速，然后加 入适当His-Tag填料，待乙醇流出，用5倍体积的去离子水洗涂凝胶树脂，再用8倍体积床 体积的Bindingbuffer平衡树脂，平衡结束后即可上样；将含蛋白的上清加入Ni柱中，冰 上解育30min,放出流穿峰，WashingBuffer洗柱4-5次，每次5倍体积，洗去杂带；Elution Buffer洗脱蛋白，收集洗脱峰，每管Iml;BindingBuffer洗柱2-3次，d地20洗2-3次，最 后将柱子存放在2-3倍体积的20%乙醇中，4°C。由于纯化后的蛋白含高浓度咪挫，所W需 将咪挫稀释成低浓度，W免影响后面肥L作用于根结线虫的生测结果。将纯化收集的洗脱 峰加入30KD大小的超滤管中，用适当体积的憐酸盐缓冲液洗涂，4°C，45(K)r/min，20min离 屯、，多次洗涂离屯、直至超滤管中剩余上清I. 5ml左右，加入ImlPBS洗脱超滤管壁上的蛋 白，收集蛋白溶液，每管IOOul分装。值得注意的是，由于肥L极易降解，故所有操作必须在 冰上进行，且纯化和浓缩尽量在一天内完成。
[0034] (2)杀线虫蛋白肥L对南方根结线虫生物活性的测定
[0035] W南方根结线虫的二龄幼虫作为祀标生物检测杀虫蛋白肥L对线虫的生物活性。 取被南方根结线虫感染过的番茄根，将番茄根用自来水轻轻冲洗干净，从根部将南方根结 线虫卵块剥离出来，用0. 5%化QO对卵块消毒2次，并用去离子水洗涂3次，然后置于25°C 培养箱中解化3-5天，解化出的南方根结线虫即可作为生物测定的祀标。生物测定实验是 在96孔板中进行，每孔中加入40-50头线虫，生测体系为100yL(具体方法参见：余子全 等，苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛 选，农业生物技术学报，2007 (15) :867-871)。整个实验设5个浓度梯度，每个浓度设3个重 复，用去离子水作为阴性对照。5天后统计死亡率，将死亡率校正后换算成几率值，结果显示 本发明的杀线虫晶体蛋白肥L蛋白对根结线虫的LC50为0. 498yg/y1。具体结果见表1。
[0036]表1肥L蛋白W南方根结线虫为祀标的生物测定
[0038] W上试验结果说明本发明的蛋白肥L对南方根结线虫具有高毒力，该蛋白为防治 根结线虫提供了一种新的资源。
【主权项】
1. 一个分离自苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis)YBT1520的杀线虫蛋白基 因NEL，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO: 1所示。2. -个分离自苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis)YBT1520的杀线虫蛋白基 因NEL，其特征在于，该基因编码的蛋白质序列如序列表SEQIDNO:2所示。3. 权利要求1所述的一个分离自苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis)YBT1520 的杀线虫蛋白基因NEL在制备杀线虫晶体蛋白中的应用，其特征在于，该基因的核昔酸序 列如序列表SEQIDNO:1所示。4. 权利要求1所述的一个分离自苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis)YBT1520 的杀线虫蛋白基因NEL在制备杀线虫晶体蛋白中的应用，其特征在于，该基因的蛋白质序 列如序列表SEQIDNO:1所示。5. -种包含杀线虫晶体蛋白基因NEL的重组的大肠杆菌（Escherichiacoli) BL(pET28a-nel)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2014326。6. 权利要求1所述基因的应用，其特征在于，所述的应用包括将杀线虫晶体蛋白在制 备微生物杀虫剂中的应用。7. 权利要求1所述基因的应用，其特征在于，所述的应用包括将杀线虫晶体蛋白在转 基因微生物或转基因植物中的应用。8. 权利要求5所述的大肠杆菌BL21EMB-nel在防治寄生线虫中的应用。9. 权利要求5所述的大肠杆菌BL21EMB-nel在制备微生物杀虫剂中的应用。10. 权利要求5所述的大肠杆菌BL21EMB-nel在转基因微生物或转基因植物中的应用。
【专利摘要】本发明属于农业微生物技术领域。具体涉及苏云金芽胞杆菌YBT1520中的杀线虫蛋白NEL的应用本发明的杀虫蛋白NEL是从苏云金芽胞杆菌YBT1520菌株基因组DNA中克隆得到，该蛋白的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ？ID？NO：2所示。从苏云金芽胞杆菌YBT1520基因芯片信息搜寻，发现杀虫蛋白NEL能够毒杀根结线虫，本发明具体公开了该杀虫蛋白基因NEL的克隆、异源表达及对根结线虫的生物测定方法该蛋白可用于微生物农药的制备和开发以及转基因植物的应用。CCTCC NO：M201432620140707
【IPC分类】A01P5/00, A01H5/00, C12R1/19, A01N47/44, C07K14/325, C12N1/21, C12N15/32
【公开号】CN105219788
【申请号】CN201510701737
【发明人】阮丽芳, 孙明, 彭东海, 王慧慧, 蔡格
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月25日