专利名称：：一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒dna的方法
技术领域：
：本发明涉及一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法。
背景技术：
：苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)在自然界中广泛存在，生活环境具有极强多样性，存在于土壤、昆虫、仓储农产品、绿色植物叶表以及水栖环境中。Bt可以产生对多种农业害虫有毒性的晶体蛋白(Insecticidalcrystalprotein,ICP)，是目前世界上使用范围最广、应用最成功的微生物杀虫剂，其杀虫基因已成功地应用到转基因抗虫植物中，是转基因抗虫植物主要的基因来源。目前已经发现Bt对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食虫目等多种昆虫具有杀虫活性。ICP蛋白由cry或cyt基因编码，除极少数cry基因定位于染色体DNA上，绝大部分毒蛋白是由Bt质粒上的基因编码的。同时，这些质粒还编码苏云金素、13"&-外毒素、杀虫晶体蛋白的调节基因以及结合转移相关基因。苏云金芽胞杆菌一般含有1-17个内生质粒，包括含有杀虫晶体蛋白的质粒以及一些没有明显表型特征的隐含质粒，这些质粒大小在2-80MD之间。由于不同分子量的质粒电泳迁移率不同，Bt内生质粒模式可以通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。对Bt质粒的分析，可以用来定位苏云金芽胞杆菌质粒编码的cry基因等功能基因，并研究质粒在不同菌株或不同种之间转移的特点。因此，清晰准确的Bt质粒图谱对菌株的鉴定以及质粒缺失突变株的分析研究有极其重要的作用。同时，高质量的质粒DNA是构建DNA文库与克隆质粒编码基因的前提条件。目前用于细菌质粒DNA抽提的方法不少，如常规的碱裂解法、SDS裂解法等，但苏云金芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌，胞壁较厚，多数易形成芽孢，而且含有的质粒大多是低拷贝的大质粒，使用常规的质粒提取方法实验结果不理想。DNA纯化试剂盒一般只适合于0.5-20kb的质粒，而且成本高，不适合大量使用。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法，以解决现有提取方法存在的质粒DNA质量低、产量不高、重复性差等缺陷。本发明利用普通琼脂糖凝胶电泳即可分析Bt的大质粒图谱、且操作简便、安全、质粒图谱清晰、重复性好，为苏云金芽胞杆菌分子生物学研究创造了有利条件，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒DNA的提取。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现—种提取苏云金芽胞杆菌质粒DNA的方法，包括以下步骤1)菌体的培养与收集挑取苏云金芽胞杆菌的单菌落于5-10mlLB液体培养基中，3(TC振荡培养过夜，lwt%转接到50-100ml新鲜LB液体基中继续振荡培养，至细菌生长密度为0D6。。=0.9-1.l，收集约80-120mg菌体于1.5ml离心管中。2)原生体的制备向收集的菌体中加入1-1.2ml预冷的溶液A悬浮细胞，12000g离心，去上清，菌体重悬于200-300ii1溶液B，37。C温育1.5-2h。3)细胞的裂解和质粒的提取向制备好的原生质体中加入200-300iU溶液C，缓慢混匀，68t:处理10min，裂解细胞；向裂解液中加入100-150yl溶液D，轻轻混匀，于-20。C中放30min;4。C12000g离心20min，将上清液转移至新1.5ml离心管内，加入lml无水乙醇，-2(TC过夜；4°C12000g离心20min，弃上清，70wt^乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀；加入200ii1无菌纯水溶解沉淀。4)质粒的纯化向上述DNA溶液中加入150-250y1的溶液E，轻轻混匀；再加入150-250ii1的Tris饱和酚，轻轻混匀；加入150-250y1的氯仿/异戊醇(体积比1:1)，轻轻混匀；12000g离心3min，小心将上层水相转移到一个新的离心管中，加入800ia无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min;12000g离心10min，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入40-70ii1溶液F，室温放置10min。其中，上述提取方法中，所述溶液A是由20-30mMTris-HCl、l-5mMEDTA、30-50mMNaCl组成，pH=8.0。所述溶液B是由溶液A中含20wt^蔗糖、2mg/ml溶菌酶和10iig/mlRNase酶组成。所述溶液C是在溶液A中加入8wt%SDS溶液。所述溶液D是3MNaAc，pH=4.8。所述溶液E是由6.0MNH4Ac和1.0mg/ml溴化乙啶组成。所述溶液F是由5.0-10.0mMTris-HCl和0.5-1.OmMEDTA组成，pH=8.0。本发明的提取方法，具有以下优点1)本发明所述的苏云金芽胞杆菌大质粒DNA提取方法操作简单，不需要较为复杂的设备，常规分子生物学或微生物学实验室就可完成。2)本发明所述的苏云金芽胞杆菌大质粒DNA提取方法，选择适宜的条件进行细菌培养及合适体积的菌液进行质粒提取，可最大限度的提高提取的效率；同时提取的质粒图谱清晰、重复性好、结构完整，A，/A，均达到了1.80，完全可以满足常规分子生物学实验的要求，为苏云金芽胞杆菌分子生物学的研究创造了有利条件。3)本发明所述的苏云金芽胞杆菌大质粒DNA提取方法，应用范围广，同样适用于其它革兰氏阳性细菌大质粒DNA的提取。图1为苏云金芽胞杆菌质粒电泳图，其中M为超螺旋DNA分子量标准，l为库斯塔克亚种标准菌株HD73质粒图谱，2为以色列亚种标准菌株Bti质粒图谱，3为野生菌株BF6-1，4为野生菌株MD5-2。具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。1、选用材料为Bt菌株及不同的血清型标准菌株(表1)。表lBt菌株及不同血清型标准菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、试剂和仪器琼脂糖，EDTA(乙二胺四乙酸)、SDS(十二烷基磺酸钠)、Tris(三羟甲基氨基甲烷)均为上海生工生物工程公司产品；溶菌酶和RNaseA为日本TaKaRa公司产品；其它试剂均为国产分析纯。凝胶电泳分析系统和凝胶成像分析系统为美国Bio-Rad公司产品。实施例1苏云金芽胞杆菌质粒DNA的分离提取1)苏云金芽胞杆菌的培养与收集分别挑取不同苏云金芽胞杆菌菌株的单菌落于5mlLB液体培养基中3(TC振荡培养过夜，lwt^转接到50ml新鲜LB液体基中继续振荡培养，至细菌生长密度为0D6。。=0.9-1.l，收集5ml菌体于1.5ml离心管中。2)原生体的制备向收集的菌体中加入1.2ml预冷的溶液A悬浮细胞，4t:12000g离心5min，去上清，菌体重悬于200y1溶液B中，37"温育1.5_2h。3)细胞的裂解和质粒的提取向制备好的原生质体中加入300溶液C，缓慢混匀，68t:处理10min，裂解细胞。向裂解液中加入150溶液D，轻轻混匀，于_20°C中放30min;4。C12000g离心20min，将上清液转移至新1.5ml离心管内，加入lml无水乙醇，_201:过夜；4。C12000g离心20min，弃上清，70wt^乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀；加入200iil无菌纯水溶解沉淀。4)质粒的纯化向上述DNA溶液中加入200ii1的溶液E，轻轻混匀；再加入200ii1的Tris饱和酚，轻轻混匀；加入200ii1的氯仿/异戊醇(体积比1:l)，轻轻混匀；12000g离心3min，小心将上层水相转移到一个新的离心管中，加入800iU无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min;12000g离心10min，弃上清，70wt%乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入50y1溶液F，室温放置10min。4、质粒DNA的浓度及纯度分析用分光光度计测定质粒DNA的0D26。和0D28。，结果见表2，发现各菌株提取的质粒DNA浓度在550-963yg/ml之间；样品0D26。/0D28。比值在1.8-2.0之间。说明获得的DNA纯度较高，完全可以满足基因克隆、鉴定等分子生物学研究需求。表2Bt菌株及不同血清型标准菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3、电泳分析将上述提取到的质粒DNA用0.7%琼脂糖凝胶进行电泳，电压60v，电泳后紫外下拍照分析(参见图1)。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。权利要求一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤1)菌体的培养与收集挑取苏云金芽胞杆菌的单菌落于5-10mlLB液体培养基中30℃振荡培养过夜，1wt％转接到50-100ml新鲜LB液体基中继续振荡培养，至细菌生长密度为OD600＝0.9-1.1，收集约80-120mg菌体于1.5ml离心管中；2)原生体的制备向收集的菌体中加入1-1.2ml预冷的溶液A悬浮细胞，12000g离心，去上清。菌体重悬于200-300μl溶液B，37℃温育1.5-2h；3)细胞的裂解和质粒的提取向制备好的原生质体中加入200-300μl溶液C，缓慢混匀，68℃处理10min，裂解细胞，向裂解液中加入100-150μl溶液D，轻轻混匀，于-20℃中放30min；4℃12000g离心20min，将上清液转移至新1.5ml离心管内，加入1ml无水乙醇，-20℃过夜；4℃12000g离心20min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，真空干燥沉淀，加入200μl无菌纯水溶解沉淀；4)质粒的纯化向上述DNA溶液中加入150-250μl的溶液E，轻轻混匀；再加入150-250μl的Tris饱和酚，轻轻混匀；加入150-250μl的氯仿/异戊醇，轻轻混匀；12000g离心3min，小心将上层水相转移到一个新的离心管中，加入800μl无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；12000g离心10min，弃上清，70wt％乙醇洗涤沉淀，室温晾干；加入40-70μl溶液F，室温放置10min；2.根据权利要求l所述的提取方法，其特征在于，所述溶液A是由20-30mMTris-HCl、l-5mMEDTA、30-50mMNaCl组成，pH=8.0。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液B是由溶液A中含20wt%蔗糖、2mg/ml溶菌酶和10yg/mlRNase酶组成。4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液C是在溶液A中加入8wt%SDS溶液。5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液D是3MNaAc，pH=4.8。6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液E是由6.0MNH4Ac和1.Omg/ml溴化乙啶组成。7.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述溶液F是由5.0-10.0mMTris-HCl和0.5-1.OmMEDTA组成，pH=8.0。8.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿、异戊醇的体积比为1:1。全文摘要本发明公开一种提取苏云金芽胞杆菌大质粒DNA的方法，包括以下步骤1)菌体的培养与收集；2)原生体的制备；3)细胞的裂解和质粒的提取；4)质粒的纯化。应用该方法得到的质粒DNA可直接用来限制性内切酶消化、PCR扩增等多种分子生物学实验。本发明操作简便、安全、质量高，可同时适用于多种革兰氏阳性细菌质粒DNA的提取，因此具有广泛的适用性。文档编号C12R1/07GK101717770SQ20091020068公开日2010年6月2日申请日期2009年12月24日优先权日2009年12月24日发明者刘华,吴潇,唐雪明,朱宏,王利刚,王金斌,蒋玲曦,谭芙蓉,赵凯,陶世如申请人:上海市农业科学院