专利名称：一种重组双顺反子表达质粒及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及使重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(即GM-CSF)在大肠杆菌中高效表达的双顺反子结构的核苷酸序列及其制备方法和用途。
GM-CSF是一种能在干细胞、祖细胞和成熟细胞不同水平上促进嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核-巨噬细胞生成和功能十分重要的造血因子。对它的基因工程研究文献报道很多，但由于其自身结构的特点，在大肠杆菌中很难获得高效表达，这给GM-CSF的工业化生产带来很大不便。
本发明的一个目的是提供一种重组人GM-CSF双顺反子表达质粒，该质粒能够使GM-CSF在大肠杆菌中高效表达。
本发明的另一个目的是提供一种上述双顺反子表达质粒的制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种上述双顺反子表达质粒的用途，所述质粒用于制备重组人GM-CSF，以及在大肠杆菌中表达所述因子。
本发明的重组人GM-CSF双顺反子高效表达质粒(表示为PBVGM2)中的双顺反子化学结构(核苷酸序列)如下5′ ATG AAA CTC GAG TAG GAG GAT TAA GAA TTC ATG GCACCA GCT CGT TCT CCA AGC CCC AGC ACG CAG CCC TGG GAGCAT GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AACCTG AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTAGAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC CTC CAG GAG CCG ACCTGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTGCGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATGATG GCC AGC CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCGGAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ACT ATC ACC TTT GAA AGTTTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCCTTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG TGA 3′。
本发明PBVGM2质粒的制备方法为将一个带有起始密码子和终止密码子的能在大肠杆菌中高效表达的寡核苷酸片段与带有起始密码子和终止密码子的GM-CSF成熟肽编码区cDNA的5′端相连，并与带有PRPL启动子的原核表达载体PBV220连接。
所述寡核苷酸片段优选为5′ATG AAA CTC GAG TAG GAG GATTAA G3′。
在本发明的优选实施方案中，所用的带起始密码子和终止密码子的寡核苷酸片段的正意链为5′ATG AAA CTC GAG TAG GAG GAT TAA G3′，反意链为3′TAC TTT GAG CTC ATC CTC CTA ATT CTT AA5′。
本发明所制得的PBVGM2质粒与原型PBVGM1质粒相比，在大肠杆菌中对GM-CSF的表达量从原来的5％提高到现在的30％。
从而本发明的质粒为GM-CSF的工业化生产提供了有利条件，并可提高生产效率，降低生产成本。
下面通过实施例详细描述本发明的最佳实施方案。实施例本发明所用的带起始密码子和终止密码子的寡核苷酸片段的正意链为5′ATG AAA CTC GAG TAG GAG GAT TAA G3′，反意链为3′TACTTT GAG CTC ATC CTC CTA ATT CTT AA5′，以上两链以等摩尔数在退火缓冲液中混合后，100℃煮3分钟，室温放置4小时使之完全退火，然后与带起始密码子和终止密码子的GM-CSF成熟肽编码区cDNA及线性PBV220原核表达载体连接。连接后所得顺序为5′寡核苷酸片段-GM-CSF cDNA3′，该融合基因受控于PBV220的PRPL启动子之下，该质粒名为PBVGM2。
将所得质粒转化大肠杆菌DH5α，使该融合基因在其中得到表达，但所表达的GM-CSF并不带有上述寡核苷酸所编码的氨基酸序列。
将原来不带上述寡核苷酸的PBVGM1质粒与现在带上述寡核苷酸的PBVGM2双顺反子质粒在相同条件下活化、诱导，然后同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，经薄层扫描表明，PBVGM1对GM-CSF的表达量占菌体总蛋白的5％，而PBVGM2双顺反子表达质粒对GM-CSF的表达量占菌体总蛋白的30％。
利用TF-1细胞，采用MTT法测定的经纯化后的GM-CSF的比活性为1×107u/mg蛋白质。
本发明的上述方案仅作为实例给出，本领域技术人员可根据本发明采用不同的实施方案，但这些方案均不脱离本发明的实质和权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子双顺反子表达质粒，其特征是其双顺反子的化学结构(核苷酸序列)如下5′ ATG AAA CTC GAG TAG GAG GAT TAA GAA TTC ATG GCACCA GCT CGT TCT CCA AGC CCC AGC ACG CAG CCC TGG GAGCAT GTG AAT GCC ATC CAG GAG GCC CGG CGT CTC CTG AACCTG AGT AGA GAC ACT GCT GCT GAG ATG AAT GAA ACA GTAGAA GTC ATC TCA GAA ATG TTT GAC CTC CAG GAG CCG ACCTGC CTA CAG ACC CGC CTG GAG CTG TAC AAG CAG GGC CTGCGG GGC AGC CTC ACC AAG CTC AAG GGC CCC TTG ACC ATGATG GCC AGC CAC TAC AAG CAG CAC TGC CCT CCA ACC CCGGAA ACT TCC TGT GCA ACC CAG ACT ATC ACC TTT GAA AGTTTC AAA GAG AAC CTG AAG GAC TTT CTG CTT GTC ATC CCCTTT GAC TGC TGG GAG CCA GTC CAG GAG TGA 3′。
2.一种如权利要求1所述的重组人GM-CSF双顺反子表述质粒的制备方法，其特征是将一个带有起始密码子和终止密码子的能在大肠杆菌中高效表达的寡核苷酸片段与带有起始密码子和终止密码子的GM-CSF成熟肽编码区cDNA的5′端相连。
3.一种如权利要求2所述的方法，其特征是将寡核苷酸片段5′ATGAAA CTC GAG TAG GAG GAT TAA G3′与人GM-CSF成熟肽编码区cDNA的5′端相连接。
4.一种如权利要求2或3所述的方法，其特征是将所述寡核苷酸片段与人GM-CSF成熟肽编码区cDNA及带有PRPL启动子的原核表达载体PBV220连接，并使该寡核苷酸片段位于GM-CSF cDNA的5′端。
5.一种如权利要求2或3所述的方法，其特征是所述寡核苷酸片段的正意链为5′ATG AAA CTC GAG TAG GAG GAT TAA G3′，反意链为3′TAC TTT GAG CTC ATC CTC CTA ATT CTT AA5′。
6.一种如权利要求4所述的方法，其特征是将所述重组入PBV220中的寡核苷酸与GM-CSF cDNA融合物在大肠杆菌中进行表达。
7.一种如权利要求6所述的方法，其特征是所述大肠杆菌为DH5α。
8.一种如权利要求1所述的重组人GM-CSF双顺反子表达质粒的用途，其特征是用于制备重组人GM-CSF。
9.一种权利要求1所述的重组人GM-CSF双顺反子表达质粒的用途，其特征是用于在大肠杆菌中表达重组人GM-CSF。
10.一种如权利要求9所述的的用途，其特征是所述大肠杆菌为DH5α。
全文摘要
本发明公开了一种重组人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的双顺反子高效表达质粒及其制备方法和用途。本发明设计了一个带起始和终止密码子的寡核苷酸片段，并将它连接到带起始和终止密码子的编码GM-CSF成熟肽cDNA的5′端，构建了人GM-CSF双顺反子高效表达质粒PBVGM2，使GM-CSF在大肠杆菌中的表达量从原来的5％提高到30％，从而为GM-CSF实现工业化生产提供了有利条件。
文档编号A61K38/21GK1130684SQ9511781
公开日1996年9月11日 申请日期1995年12月6日 优先权日1995年12月6日
发明者刘丽, 冯彪, 王国志, 谢宝树, 冷爱军 申请人:中国人民解放军空军总医院