通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗的制作方法
【专利说明】通过酶缀合在大肠杆菌中生产重组疫苗
[0001] 1-前言 在本文中提供了在体内熟练生产糖缀合物的原核细胞，以及用于产生这些细胞的方法 和使用这些细胞生产糖缀合物的方法。还包括了提及的糖缀合物的组合物以及它们的不同 用途。
[0002] 2-背景 糖基化是将碳水化合物分子或糖(单糖、二糖、寡糖或多糖）连接至蛋白质或多肽的不 同氨基酸残基的侧链以产生糖蛋白的过程。
[0003] 糖蛋白涉及数个过程诸如，细胞相互作用和细胞信号传导；它们参与分泌蛋白和 膜蛋白的蛋白质折叠、寡聚化、稳定性、质量控制、分选和转运。蛋白质糖基化在蛋白质的抗 原性、稳定性和半衰期上具有深远的有利影响。
[0004] 存在不同种类的糖蛋白，其取决于碳水化合物分子和蛋白质载体中氨基酸残基之 间的键的类型。
[0005] N-连接蛋白质糖基化一一将碳水化合物分子添加至靶蛋白的多肽链的天冬酰胺 残基一一是发生在真核生物内质网中的最常见的翻译后修饰类型。该过程通过酶促的寡糖 基转移酶复合体（0ST)完成，其在内质网中负责将来自脂质载体(磷酸多萜醇）的预装配寡 糖转移至新生蛋白质保守序列Asn-X-Ser/Thr(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)内 的天冬酰胺残基。随后糖链在高尔基体中经历其他修饰。N-连接糖基化过程出现在真核生 物中并广泛出现在古细菌中，但是在细菌中非常罕见(见下文)。
[0006] 0-连接糖基化是在真核生物、古细菌和细菌中出现的糖基化形式。其包括将糖分 子连接至蛋白靶的氨基酸残基中的氧原子。
[0007]已经显示由于其具有其自身的糖基化机器（glycosylationmachinery)，细菌食 源性病原体空肠弯曲杆菌（CaWjOjioAacter 也可以使其蛋白质N-糖基化（Wacker 等人，Scimce. 2002; 298(5599) : 1790-3)。负责该反应的机器由称为pgl(指蛋白质糖 基化）的簇编码。
[0008] 可以将空肠弯曲杆菌的糖基化机器转移至大肠杆菌（AcWi)中，以允许通过大 肠杆菌细胞表达的重组蛋白质的糖基化。先前的研究已经证明如何产生可以执行N-糖 基化的大肠杆菌菌株（参见，例如，Wacker等人，Scieflce. 2002; 298 (5599): 1790-3; Nita-Lazar等人，2005; 15 (4): 361-7;Feldman等人， 2005; 102(8):3016-21;Kowarik等人，沒股？ 激你；25(9):1957-66; Wacker等人，Z5rocA2006; 103(18) :7088-93;国际专利申请公开 号恥2003/074687、恥2006/119987、恥 2009/104074和恥/2011/06261和恥2011/138361)。
[0009] 可以将细菌分为两类，革兰氏阳性和革兰氏阴性，这取决于它们是否具有 通常由荚膜多糖包围的单层或双层鞘细胞膜。这样的细菌的实例包括链球菌属亚 种（ssp.)、假单胞菌属亚种敵wasssp.)、奈瑟氏菌属亚种 (AfeiMeriassp.)、沙门氏菌属亚种（ssp.)、埃希氏菌属亚种（fccAericAia ssp.)、葡萄球菌属亚种ssp.)、弯曲杆菌属亚种（Ca厚)jioAacterssp.) 等。在医学和商业上最相关的感染原之一是肺炎链球菌（/wei/mwiae)，为 革兰氏阳性病原体。
[0010] 肺炎链球菌是全世界轻度感染和重度感染两者的主要原因。与肺炎球菌感染有关 的主要临床综合征是肺炎、脑膜炎、血流感染和急性中耳炎，按照发病率和死亡率肺炎是这 些当中最重要的。由肺炎链球菌导致的感染尤其是在非常年轻的人和老年人中的重大疾病 负担的原因（IsaacmanDJ,M.E.，ReinertRR. 2010.Burdenofinvasivepneumococcal diseaseandserotypedistributionamongStreptococcuspneumoniaeisolates inyoungchildreninEurope:impactofthe7-valentpneumococcalconjugate vaccineandconsiderationsforfutureconjugatevaccines.IntJInfectDis. 14:197-209)。
[0011] 肺炎球菌被分为数个血清型（~93)(基于它们的化学上和血清学上不同的荚 膜多糖)。某些血清型比其他更丰富，与临床上显性感染相关，导致严重的侵入性感染 并且获得对一类或多类抗菌剂的耐药性（Rueda，A.M.M.，MSc;Serpa，Jos6A. MD;Matloobi,MahsaMD;Mushtaq,MahwishMD;Musher,DanielM.MD. 2010.The spectrumofinvasivepneumococcaldiseaseatanadulttertiarycarehospital intheearly21stcentury. (Baltimore) 89:331-336)。已经基于多糖荚膜 的结构区别鉴定了肺炎链球菌的不同血清型。根据先前的分析，约10或11种血清型占 据了世界上全部地区超过70%的侵入性小儿感染（HausdorffWP，BryantJ，Paradiso PR,SiberGR:Whichpneumococcalserogroupscausethemostinvasivedisease: implicationsforconjugatevaccineformulationanduse,partI.Clinical infectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSociety 2000，30(1):100-121)。引起疾病的血清型的分布随年龄、疾病综合征、疾病 严重度、地理区域和随时间而不同。对青霉素、红霉素、复方增效磺胺（co-trimoxazole)或 多种药物有耐药性的肺炎球菌在很多地区是常见的（Evolvingtrendsin pneumoniaeresistance:implicationsfortherapyofcommunity-acquiredbacterial pneumonia.JonesRN，JacobsMR,SaderHS.IntJAntimicrohAgents.2010 S印；36(3) : 197-204)。
[0012] 肺炎球菌荚膜是主要的细菌毒力因子之一并且已成功作为抗原在多种疫苗中 使用。针对荚膜多糖的抗体已经显示出针对肺炎球菌感染是保护性的（MusherDMPH，WatsonDA,BaughnRE:AntibodytocapsularpolysaccharideofStreptococcus pneumoniaeatthetimeofhospitaladmissionforPneumococcalpneumonia.J InfectDis2000, 182(1):158-167>IsaacmanDJME,ReinertRR:Burdenofinvasive pneumococcaldiseaseandserotypedistributionamongStreptococcuspneumonias isolatesinyoungchildreninEurope:impactofthe7-valentpneumococcal conjugatevaccineandconsiderationsforfutureconjugatevaccines.IntJ 2010，14(3) :197-209)。
[0013] 肺炎球菌荚膜多糖（CPS)合成途径根据血清型（~93)而不同。除了类型3和37是 通过合酶途径合成（BentleySD，AanensenDM，MavroidiA，SaundersD，Rabbinowitsch E，CollinsM，DonohoeK，HarrisD，MurphyL，QuailMA等人：Geneticanalysis ofthecapsularbiosyntheticlocusfromall90pneumococcalserotypes.PLoS2006，2(3) :e31)，肺炎链球菌CPS-般通过0-抗原-翻转酶（Wzx) /聚合酶 (Wzy)-依赖途径合成（图1)。
[0014] CPS通过分步方法在载体脂质上从共同前体(例如核苷酸活化的单糖)装配。首先， 通过不同的糖基转移酶将重复单元装配在膜的细胞质一侧的载体上。连接脂质的寡糖随后 翻转至膜外侧，重复单元在此聚合。完成的CPS从载体脂质释放并且输出至表面。
[0015] 细菌多糖可以在人中引起持久的免疫应答(如果它们与含有T-细胞表位 的蛋白质载体偶联)。该概念在几乎1〇〇年前被阐述（Avery, 0.T.和W.F.Goebel, 1929.Chemo-immunologicalstudiesonconjugatedcarbohydrate-proteins. Immunologicalspecificityofsyntheticsugar-proteins,y.Exp.Med. 50:521-533)，并且随后对偶联至蛋白质载体白喉毒素的乙型流感嗜血杆菌（//aiJ _/刀/7此/7幼typeB) (HIB)的多糖证实（Anderson,P. 1983.AntibodyresponsestoHaemophilusinfluenzaetypebanddiphtheriatoxininducedbyconjugatesof oligosaccharidesofthetypebcapsulewiththenontoxicproteinCRM197.Infect Immun39:233-8;Schneerson,R.，0?Barrera,A.Sutton,和J.B.Robbins. 1980. Preparation,characterization,andimmunogenicityofHaemophilusinfluenzae typebpolysaccharide-proteinconjugates.JExpMed152:361-76)。该糖缀合 物还是于1987年在美国许可的第一种缀合疫苗，并且不久之后被引入美国婴儿免疫计 划表。除了HIB，已经成功地开发了针对有荚膜的人病原体脑膜炎奈瑟氏菌（ 和肺炎链球菌的缀合疫苗。这些疫苗的常规使用已经导致了减少的鼻咽建 群以及感染。目前~25%的全球疫苗市场包括缀合疫苗。
[0016] 已经成功使用缀合疫苗针对细菌感染进行保护。由于多糖是T-细胞不依 赖性抗原，因此抗原性多糖对蛋白质载体的缀合是保护性记忆应答所必需的。使用 多糖中的活化反应基团以及蛋白质载体，多糖已通过不同的化学方法缀合至蛋白质 载体（Pawlowski,A.，G.Kallenius,和S.B.Svenson. 2000.Preparationof pneumococcalcapsularpolysaccharide-proteinconjugatesvaccinesutilizingnew fragmentationandconjugationtechnologies.Vaccine18:1873-1885;Robbins,J. B. ,J.Kubler-Kielb,E.Vinogradov,C.Mocca,V.Pozsgay,J.Shiloach,和R. Schneerson. 2009.Synthesis,characterization,andimmunogenicityinmiceof Shigellasonnei〇-specificoligosaccharide-core-proteinconjugates.ProcNatl AcadSciUSA106:7974-7978 )〇
[0017] 缀合疫苗可以对儿童施用以保护他们免于细菌感染并且可以对成人提供持久的 免疫应答。已发现本发明的构建体在动物中产生IgG应答。相信多糖（即糖残基)引发了糖 特异性的短期免疫应答。确实，人免疫系统对细菌的特定多糖表面结构，诸如〇-抗原和荚 膜多糖产生强烈的应答。然而，由于对多糖的免疫应答是IgM依赖性的，因此免疫系统不发 生记忆。然而，携带多糖的蛋白质载体引发了T-细胞依赖性的IgG应答，并且因为免疫系 统发生记忆因而所述IgG应答提供持久保护。由于该原因，开发作为蛋白质载体-多糖缀 合物的疫苗是有利的。
[0018] 纯肺炎球菌多糖疫苗在幼小儿童中诱导对重要血清型的保护性免疫应答的无能 性将其从婴儿免疫的考虑中排除。
[0019] 至今，针对肺炎球菌疾病的疫苗是通过良好建立的化学缀合技术在体外合成的。 抗原性荚膜多糖被从病原生物中提取，纯化、化学活化并且缀合至合适的蛋白质载体。目 前，存在用于生产糖缀合物的不同的蛋白质载体，例如CRM197(白喉类毒素)、破伤风类毒素 和流感嗜血杆菌蛋白D。
[0020] 已经在数年前许可了 7价肺炎球菌缀合疫苗（PCV7)，并且其已经被WHO的 StrategicAdvisoryGroupofExperts(SAGE)推荐在具有高疾病负担的发展中国家使 用（吻2012Jul6;30(32):4717_8.Epub2012May20.Pneumococcalvaccines WHOpositionpaper- 2012 -recommendations.WHOPublication)。同样已经在多个 国家批准了 10价（PCV10)和13价（PCV13)缀合疫苗。另外的缀合疫苗处于开发的不同阶 段（JiangSM,WangL和ReevesPR:MolecularcharacterizationofStreptococcus pneumoniaetype4, 6B, 8,and18Ccapsularpolysaccharidegeneclusters.Infect /a鹽m2001, 69 (3): 1244-1255)。
[0021] 在化学缀合疫苗生产的背景下已经鉴定了数个问题。用于缀合的多糖的化学 处理已经显示出损害了多糖的天然构象，其影响了抗原的质量，因此影响了最终产品的 抗原性和免疫原性（Impactoftheconjugationmethodontheimmunogenicityof Streptococcuspneumoniaeserotype19Fpolysaccharideinconjugatevaccines (PoolmanJ,FraschC,NurkkaA,KayhtyH,BiemansR,SchuermanL.ClinVaccine Immunol.2011Feb;18(2):327-36.Epub2010Decl)〇
[0022] 3-发明概述 本发明描述了生产含有来自肺炎球菌细胞的多糖的糖缀合疫苗的新方法。该创新性的 肺炎球菌疫苗是基于以下发现：涉及革兰氏阳性菌的寡糖或多糖生物合成的调苄基因可以 用于在革兰氏阴性宿主菌株中有效地合成寡糖和多糖，并且以该方法生产的寡糖或多糖可 以用于在革兰氏阴性宿主细胞中制造糖缀合疫苗。本发明的进一步新的和意想不到的特征 包括且不限于下文陈述的实施方案。
[0023] 本发明描述了用于基于肺炎球菌多糖的缀合疫苗的生产的原始程序。所述程序基 于多个步骤： i) 在大肠杆菌中使用提高多糖生产效率的调苄基因，将肺炎球菌多糖重组生产为i^一 异戊稀焦磷酸（undecaprenyl-pyrophosphate,Und-PP)连接的0抗原样多糖。 ii) 通过缺失初始菌株的特定功能开发合适的生产菌株以使得多糖生产更有效率。 iii) 设计允许在大肠杆菌中肺炎球菌多糖的有效重组合成的合适DNA构建体。 iv) 通过寡糖基转移酶使多糖和受体蛋白在体内有效缀合的方法。
[0024] 4-附图简述 图1描述了肺炎链球菌的荚膜多糖生物合成途径的遗传构成。用于体内缀合的肺炎链 球菌的荚膜多糖生物合成途径的一般遗传构成的示意图。
[0025] 图2显示了涉及CPS1生物合成的遗传构成。CPS1遗传构成，r頌至堤涉及 荚膜多糖的生物合成的基因。
[0026] 图3说明了CPS1亚基。CPS1亚基的示意图。
[0027] 图4显示来自索氏志贺氏菌（51so/Mei)和类志贺邻单胞菌（Z3. 的0抗原亚基。索氏志贺氏菌和类志贺邻单胞菌重复单元的示意图。
[0028] 图5显示了类志贺邻单胞菌017抗原簇。类志贺邻单胞菌017 0抗原簇。
[0029] 图6展示了在大肠杆菌中肺炎链球菌CPS1多糖的生产。在大肠杆菌中肺炎链球 菌CPS1多糖的生产。来自使用质粒pGVX767 (含有完整的CPS1生物合成基因， 转化的不同大肠杆菌菌株的蛋白酶K处理的全细胞提取物的蛋白质印迹分析。泳道1，蛋 白质标志物；泳道 2,大肠杆菌GVX2174 (W3110AwaaLAwecAwzzECAAr/K)16::r/&类 志贺邻单胞菌017-chA);泳道3,使用pGVX767 (pLAFR编码启动子、RBS和CPS1型的 r双-y济/)转化的大肠杆菌GVX2174 ;泳道4和5,使用pGVX767转化的大肠杆菌GVX3329 (=GVX2174 W3110AraaZAredr從汉^ : ( &类志贺邻单胞菌 017A: )。样品在 12%Bis-Tris凝胶（invitrogen)上使用MES在 200V下电 泳35分钟，并且随后在iBlot中进行印迹，并且通过作为一级抗体的抗-CP1抗体（1:250) 显色。ch对旨示了赋予氯霉素（el