专利名称：分泌表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌表达系统的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及通过基因工程方法制备重组人表皮生长因子(rhEGF)。
背景技术：
人表皮生长因子(Human epidermal growth factor，简称hEGF)，是一种不带糖基，由53个氨基酸组成的单链多肽，分子量为6,216道尔顿。hEGF是人体内一种重要的多肽生长因子，它具有多种生物学功能，可与表皮细胞上特异的受体结合，将信息传递入细胞，改变细胞内的酸碱度和游离钙浓度，促进糖酵解和蛋白质的合成，增加某些专一性基因转录，从而促进DNA复制和细胞分裂。EGF可促使多种细胞分裂，可促进表皮细胞、神经细胞和器官组织的上皮细胞生长。在生物体发育中，EGF还可促进新生儿牙齿、骨骼与各器官的生长。临床试验结果表明，hEGF可促使外胚层、中胚层细胞生长，促进烧伤、创伤及外科伤口的愈合，加速移植表皮和移植角膜的生长，因此，对创烧伤救治、皮肤和角膜移植、外伤性皮肤溃疡、角膜溃疡、胃肠道溃疡及应激性胃粘膜损伤的治疗均有重要作用。近年来，国外已将hEGF用于鳞状细胞癌、皮肤癌的治疗，取得了显著的疗效。
hEGF广泛存在于人的体液和某些腺体及组织中，但含量极低，不可能以组织提取方式大量制备供研究和临床用。在先前的研究中，本发明者们采用基因工程的方法，将人工合成的hEGF基因、大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子和信号肽序列克隆至质粒pTZ18R中，构建成分泌表达质粒pAE-8并得到工程菌株EE-8。该工程菌株成功地分泌表达rhEGF，最高表达量为150mg/l(专利申请CN00127953.X)。
大肠杆菌碱性磷酸酯酶启动子是一种中等强度的启动子，利用上述启动子已使rhEGF的表达量达到150mg/l，如果改用更强的启动子，比如PL强启动子是否能使rhEGF的分泌表达量再上一个台阶呢？带着这一想法，本发明者们开始了实验设计，同时，考虑到PL启动子一旦启动，可能会使rhEGF瞬时大量表达，造成大肠杆菌胞内的转运系统来不及将rhEGF分泌至胞外，而使rhEGF大量聚集在胞内。为了提高rhEGF的透膜分泌效率，本发明者们从设计信号肽着手，顺利完成了表达质粒和工程菌株的构建和发酵条件的优化，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一个全新设计的信号肽(phoAspL10)序列。
本发明的另一个目的是提供分泌表达重组人表皮生长因子(rhEGF)的表达质粒pBL10EGF。
本发明的再一个目的是提供表达质粒pBL10EGF转化的宿主细胞。
本发明的还有一个目的是提供基因工程菌BE-2。
本发明的进一步的目的是提供信号肽phoAspL10和表达质粒pBL10EGF在制备直接分泌表达的rhEGF上的应用。
本发明的进一步的目的是提供直接分泌表达rhEGF至培养基的rhEGF制备方法。
发明内容
本发明提供一个全新设计的信号肽(phoAspL10)基因(SEQ ID NO1)5’ATG AAA CAA AGC ACT CTG CTG CTG CTG CTG CTT CTG CTG CTGCTG ACC CCT GTG ACA AAA GCG 3’本发明还提供分泌表达重组人表皮生长因子的表达质粒pBL10EGF，其包含所述的全新设计的phoAspL10基因，及位于所述基因上游的温敏启动子PL和位于所述基因下游的hEGF基因。所述温敏启动子PL的来源见Giladi H，Goldenberg D，Koby S，Oppenheim AB.Enhanced activity of the bacteriophage lambda PL promoter at lowtemperature.FEMS Microbiol Rev.1995 Aug；17(1-2)135-40.
本发明的表达质粒pBL10EGF中，所含的重组蛋白基因包含目前所有已知人体的多肽和蛋白基因。
本发明提供的宿主细胞是具有氨苄青霉素抗性的、表达质粒pBL10EGF转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
本发明还提供分泌表达rhEGF的工程菌株BE-2，所述的工程菌株是从表达质粒pBL10EGF转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞筛选出的表达量最高的菌株。
本发明提供的直接分泌表达rhEGF至培养基的rhEGF制备方法包括如下步骤(1)化学合成phoAspL10序列；(2)以pBLGlu2为起始质粒构建表达质粒pBL10EGF；(3)构建和筛选出基因工程菌株BE-2；(4)基因工程菌BE-2的发酵培养；(5)表达产物的分离纯化。
本发明者设计的信号肽phoAspL10是一种全新的序列，其长度为21个氨基酸，其中第6至第15个氨基酸设计成非极性氨基酸-亮氨酸。信号肽phoAspL10较大肠杆菌碱性磷酸酯酶信号肽的疏水性更强，更利于rhEGF的透膜和分泌。
本发明者们根据上述的实验设计，顺利地完成了表达质粒和工程菌株的构建。在本发明构建的分泌表达质粒pBL10EGF中，将PL强启动子、全新设计的phoAspL10序列和hEGF基因进行串联。这种表达方式的最大好处是直接高效分泌表达rhEGF至培养基中，保留了其天然的空间结构，产物不需要经过蛋白复性，因而表达产物的生物活性很高，也使得后续的分离纯化步骤得以简化。而其它采用PL启动子表达蛋白的方法，要么表达产物在胞内形成包涵体，产物在纯化后还要进行蛋白复性，要么表达产物被表达至细菌的周质中，给后续的分离纯化带来很大的麻烦。
在对工程菌株的发酵条件和诱导温度进行摸索的基础上，本发明者们发现，在38℃诱导时，rhEGF的分泌表达量要较通常采用的42℃诱导时为高。在此优化的发酵和诱导条件下，工程菌株BE-2表达rhEGF的最高量达到384mg/l，经过分离纯化，得到纯度大于95％、比活性大于1.0×106IU/mg蛋白的rhEGF产品，完全达到了预期的效果。
以上的研究结果为今后表达其它重组多肽或蛋白时提供了多种选择采用PL启动子、全新设计的phoAspL10序列串联的表达系统或大肠杆菌碱性磷酸酯酶表达系统。
图1为表达质粒pBL10EGF构建示意图。
图2为阳性克隆核酸电泳图。其中，第1栏为DNA标记；第2栏为阴性对照；第3栏为阳性对照；第4栏为空白；第5栏为阳性克隆。图3为工程菌株筛选SDS-PAGE电泳图。第1栏为阴性对照(YK537空菌)；第2栏为hEGF对照；第3栏为BE-1；第4栏为BE-2；第5栏为BE-3；第6栏为BE-4；第7栏为BE-5；第8栏为BE-6。
图4A为工程菌株BE-2的发酵曲线图。图4B为工程菌株BE-2的诱导表达电泳图。其中，第1栏为hEGF对照；第2-6栏分别为诱导培养20、22、25、26和27小时上清。
图5为疏水层析图。
图6为阴离子交换图。
图7为凝胶过滤图。
图8为SDS-PAGE电泳检定图。其中，第1栏为蛋白分子量标记(自下而上依次为10K，20K，30K…100K)；第2栏为对照hEGF；第3栏为rhEGF产品。图9为反相HPLC检定图。
图10为分子量测定图。
图11为N端氨基酸序列测定数据。
图12为生物活性测定图。
下面用实施例对本发明进行详细描述。这些实施例仅仅是举例说明，并不对本发明构成任何限制。
实施例1 化学合成信号肽phoAspL10序列和人表皮生长因子(hEGF)的串联基因(SEQ ID NO2)↓起始密码子5’GAT ACC AAA CAA AGC ACTCTG CTG CTG CTG CTG CTT CTG CTG| ← 全新设计的信号肽序列(下划线部分为CTG CTGACC CCT GTG ACA AAA GCG AAT TCC GAC TCT GAA TGC CCG连续十个亮氨酸) →|←CTG TCT CAC GAC GGT TAC TGC CTA CAC GAT GGT GTT TGC ATG TAT人表皮生长因子(hEGF)基因ATC GAA GCT CTG GAC AAA TAC GCG TGC AAC TGT GTT GTT GGT TACATC GGT GAA CGT TGC CAG TAC CGT GAC CTG AAA TGG TGG GAA CTG
我们在设计合成上述串联基因时，充分遵循了以下原则即选用大肠杆菌偏爱的密码子；AT、GC含量接近且分布均匀；片段内避免二级结构的产生。
在上述串联基因的下游末端，我们设计了限制性内切酶HindIII的酶切位点，便于基因克隆(基因及引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。
实施例2 表达质粒的构建(图1)2.1起始载体pBLGlu2的酶切处理2.1.1 EcoRI酶切配制如下反应混合液10μg质粒pBLGlu2；20μl 10×H缓冲液(TaKaRa公司)；5μl EcoRI限制性内切酶(15U/μl，TaKaRa公司)；灭菌双蒸水补足200μl。
将上述反应混合液于37℃反应4小时。
2.1.2酶切后载体的回收在2.1.1所得的反应混合液中加入20μl 3M乙酸钠和400μl无水乙醇，充分混匀后，于12,000rpm离心5分钟，弃上清，再加入400μl 70％乙醇，充分混匀，12,000rpm离心2分钟，弃上清，真空抽干。
2.1.3绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)酶切配制如下反应混合液2.1.2中回收的载体；10μl 10×绿豆核酸酶缓冲液(TaKaRa公司)；1μl Mung Bean Nuclease(45U/μl，TaKaRa公司)；灭菌双蒸水补足100μl。
将上述反应混合液于30℃反应30分钟。
2.1.4 DNA片段的回收将2.1.3中所得的DNA片段用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)按试剂盒说明书上的操作步骤进行回收，用50μl洗脱液洗脱。
2.1.5保温将2.1.4中所得的洗脱液于65℃保温10分钟。
2.1.6 HindIII酶切配制如下反应混合液2.1.5中的洗脱液；6μl 10×M缓冲液(TaKaRa公司)；2μl HindIII限制性内切酶(15U/μl，TaKaRa公司；)灭菌双蒸水补足60μl。
将上述反应混合液于37℃反应过夜。
2.1.7 DNA大片段的回收将2.1.6中酶切过夜的反应液进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下切下大条带，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)按试剂盒说明书上的操作步骤回收DNA大片段，用50μl洗脱液洗脱。
2.2 phoAspL10、hEGF串联基因的酶切处理取化学合成的1OD上述串联基因用200μl灭菌双蒸水溶解，取10μl作HindIII酶切处理。
配制如下反应混合液10μl phoAspL10、hEGF串联基因；4μl 10×M缓冲液(TaKaRa公司)；2μl HindIII限制性内切酶(15U/μl，TaKaRa公司)；灭菌双蒸水补足40μl。
将上述反应混合液于37℃反应过夜，然后进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下切下大条带，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)按试剂盒说明书上的操作步骤回收DNA大片段，用50μl洗脱液洗脱。
2.3连接配制如下反应混合液5μl 2.1.7中经处理后的载体大片段；12μl 2.2中经HindIII酶切的phoAspL10、hEGF串联基因；2μl 10×T4DNA连接酶缓冲液(TaKaRa公司；)1μl T4DNA连接酶(350U/μl，TaKaRa公司)。
将上述反应混合液于16℃反应过夜。
2.4感受态细胞的制备将10μl TOP10甘油菌接种至3ml LB培养基中，37℃ 200rpm培养过夜，取100μl菌液再接入3ml LB培养基中，37℃ 200rpm培养至A6000.3～0.4，然后4,000rpm离心10分钟，弃上清，菌体以预冷的钙溶液(0.1mol/l CaCl2)洗涤，4,000rpm离心10分钟，菌体重悬于200μl的钙溶液中备用。
2.5转化取2.3中的连接产物，加入2.4中制备的感受态细胞中，冰浴30分钟，然后于42℃热休克90秒，随后加入800μl LB培养基，于37℃，100rpm，振摇30分钟，取100μl涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板(琼脂含量为1.5％)，37℃倒置培养过夜。
2.6筛选阳性克隆合成phoAspL10、hEGF串联基因的上游引物和下游引物(1OD上述引物分别用400μl灭菌双蒸水溶解备用)，用于PCR反应筛选阳性克隆，引物序列如下上游引物(21bp)5’GAT ACC ATG AAA CAA AGC ACT 3’(SEQ ID NO3)；下游引物(18bp)5’CCC AAG CTT ATT AAC GCA 3’(SEQ ID NO4)。
用无菌牙签挑取2.5中长出的若干菌落于3ml LB(其中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)中，在37℃，200rpm培养过夜，以菌落培养液作为模板进行PCR反应。每个菌落培养液试样按以下组合和反应条件进行PCR反应。
配制如下反应混合液0.25μl Ex Taq(5U/μl，TaKaRa公司)；5μl 10×Ex Taq缓冲液(TaKaRa公司)；4μl dNTP Mixture(TaKaRa公司)；1μl上游引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；1μl下游引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；1μl菌落培养液；灭菌双蒸水补足50μl。
反应条件94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 40秒，共30个循环。
PCR反应的阴性对照用1μl灭菌双蒸水代替菌落培养液，阳性对照用2.2中溶解的1μl phoAspL10、hEGF串联基因代替菌落培养液。取PCR反应液20μl进行1.5％琼脂糖电泳，在紫外灯下，菌落培养液试样的PCR反应产物于240bp左右处出现条带的即为阳性克隆(见图2)。
2.7质粒的小量抽提取阳性克隆的培养液10μl接种至3ml LB培养基(其中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)中，37℃ 200rpm培养过夜，用UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，按试剂盒说明书上的操作步骤抽提阳性克隆的质粒。
2.8 DNA序列测定我们合成了测序引物(5’AGC ACA TCA GCA GGA CGC A 3’，19bp，SEQID NO5)，对阳性克隆进行DNA序列测定(委托上海博亚生物技术有限公司)。测序结果表明，在我们构建的表达质粒pBL10EGF中，phoAspL10、hEGF串联基因的DNA序列与我们设计的完全一致。
通过上述步骤，我们完成了表达质粒pBL10EGF的构建工作。
实施例3 基因工程菌株的构建和筛选
3.1基因工程菌株的构建按2.4中的方法制备大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，按2.5中的方法将表达质粒pBL10EGF转化入BL21(DE3)的感受态细胞中，取100μl涂布含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板(琼脂含量为1.5％)，37℃倒置培养过夜。
3.2基因工程菌株的筛选3.2.1基因工程菌株的诱导表达挑取3.1中获得的单菌落放入3毫升LB培养基(其中氨苄青霉素的浓度为100μg/ml)中，37℃ 200rpm过夜培养，然后按1∶10的比例转接入LB培养基中，再继续培养4小时后升温至42℃，培养6小时后结束。取1ml培养液上清作为试样，加入三氯乙酸至终浓度为10％，12,000rpm离心5分钟，弃上清，加入1ml丙酮于12,000rpm离心5分钟，弃上清，晾干沉淀备用。
3.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳分析SDS-PAGE凝胶的配方如下
将3.2.1中制备的上清液试样沉淀加入1×载样缓冲液，在沸水浴中放置5分钟后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(电压200伏，45分钟)，根据电泳结果，rhEGF表达量最高的该菌株即为筛选得到的基因工程菌株，命名为BE-2(见图3)。
1×载样缓冲液10％SDS 1.5ml，巯基乙醇250μl，甘油500μl，0.75MTris·HCl(pH6.8)330μl，溴酚兰适量，用水定容至20ml。
1×电泳缓冲液15.1g Tris，94g甘氨酸，50ml 10％SDS，用浓盐酸调pH至8.3后再用水定容至5,000ml。
实施例4 基因工程菌BE-2的发酵培养种子培养基为LB培养基。
发酵培养基配方如下酵母抽提物10g/l，蛋白胨，20g/l，氯化钠10g/l，葡萄糖5g/l。
取700μl实施例3中筛选得到的基因工程菌BE-2甘油菌，接入25ml LB培养基中，于30℃、250rpm培养12小时，再以2.8％的接种量转接到50ml LB培养基中，同样条件下培养10小时，然后按6％的接种量接入到装有2.5升发酵培养基的5升发酵罐中进行发酵。培养温度设定为30℃，通气量为4ml/min，pH为7.0，初始搅拌转速为400rpm，溶氧控制在20％。葡萄糖耗完后开始以恒pH方式流加250g/l葡萄糖，控制pH值为7.0。培养12小时后菌体浓度OD600大约为36，升温至38℃开始诱导。诱导表达阶段流加含葡萄糖(250g/l)和酵母抽提物(200g/l)的混合液，初始流加速率为12.6ml/h，逐渐以阶梯方式递增到25.4ml/h。培养27小时，培养基中rhEGF的最高表达量为384mg/l(见图4)。
实施例5 表达产物的分离纯化5.1超滤将实施例7中获得的培养基上清液用截留分子量为5,000的超滤膜进行超滤浓缩，通过这一步骤除去分子量小于5,000的杂质并对上清液进行浓缩，最终浓缩后的体积约为初始体积的1/10。
5.2疏水层析超滤液中加入固体硫酸铵至终浓度为10％(质量百分比)，过滤后，上PhenylSepharose 6 Fast Flow柱(Φ35×300mm)，先用10％硫酸铵溶液冲洗，再用50mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱，收集含rhEGF的组份(见图5)。
5.3阴离子交换用50mM Tris·HCl(pH7.2)缓冲液将5.2中收集的组份稀释十倍后上QSepharose Fast Flow柱(Φ35×300mm)，先用50mM Tris·HCl(pH7.2)缓冲液冲洗，再用2M NaCl在三个柱体积内从0-100％进行梯度洗脱，收集含rhEGF的组份(见图6)。
5.4凝胶过滤将5.3中rhEGF组份用真空冷冻干燥法浓缩体积后再上Superdex 30 prep grade柱(Φ35×1200mm)，流动相为50mM磷酸缓冲液(pH7.0)，收集含rhEGF的组份(见图7)。
实施例6 纯化产物的检定6.1纯度检定6.1.1SDS-PAGE凝胶电泳扫描经计算机扫描分析，rhEGF产品的纯度大于95％，达到96.8％(见图8)。
6.1.2反相HPLCHPLC分析条件如下分析柱RP-300 C8柱(Φ2.1×30mm)。
缓冲液A0.1％TFA。
缓冲液B0.1％TFA，90％乙腈。
梯度 0％～100％B，30分钟内。
流速 0.4ml/min。
经计算机积分分析，rhEGF产品的纯度大于95％，达到98.3％(见图9)。
6.2分子量测定委托中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组研究分析中心测定，rhEGF产品试样的分子量为6,216道尔顿(见图10)。
6.3N端氨基酸序列分析委托中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质组研究分析中心分析，共测定了rhEGF产品试样N端的15个氨基酸，其N端序列为Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu(SEQ IDNO6)，与天然人表皮生长因子序列的N端氨基酸序列一致(见图11)。
6.4效价测定(生物活性测定)采用Balb/c3T3细胞MTT法测定。取对数生长期的Balb/c3T3细胞，经胰蛋白酶消化后，用RPMI1640+10％FBS培养液制成6×104/ml细胞悬液，接种于96孔板(0.1ml/孔)，置37℃、5％CO2培箱24小时；吸去原培基，加入RPMI1640+0.4％FBS培基0.1ml/孔，37℃、5％CO2培箱饥饿培养细胞24小时；吸去原培基，加入用RPMI1640+0.4％FBS培基稀释的标准品和试样0.1ml/孔标准品先预稀释至50IU/ml，再进行一系列的4倍稀释，试样同样预稀释至50ng/ml，再进行一系列的4倍稀释，每个稀释度做两个重复，置37℃、5％CO2培箱72小时；每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl，置37℃、5％CO2培箱4小时；每孔吸去80μl上清，加入DMSO 100μl，混匀，测定OD570值。以试样的浓度为横坐标，OD570值为纵坐标作图，用计算机S形曲线回归计算法进行数据处理，计算出样品及标准品的ED50。根据下式计算出样品的效价X1X1＝X0×(D1/D0)×(E0/E1)其中X0为标准品的效价，D1为样品的预稀释倍数，D0为标准品的预稀释倍数，E1为样品的ED50，E0为标准品的ED50。
经测定，rhEGF试样的比活性大于1.0×106IU/毫克蛋白，达到1.21×106IU/mg蛋白(见图12)。
以上描述的具体实施方式
旨在阐述本发明的最佳实施方式而不是以任何形式限制本发明。本领域技术人员根据本发明的启示，结合本领域的常识所做的各种变更，均落在本发明专利申请的权利要求范围内。
序列表<110>甘人宝、钱悦、朱俊、冯宝山、丁红珍、张倩、叶勤、张海毅<120>分泌表达重组人表皮生长因子的大肠杆菌表达系统<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>63<212>DNA<213>人工合成<400>1atgaaacaaa gcactctgct gctgctgctg cttctgctgc tgctgacccc tgtgacaaaa60gcg 63<210>2<211>241<212>DNA<213>人工合成<400>2gataccatga aacaaagcac tctgctgctg ctgctgcttc tgctgctgct gacccctgtg60acaaaagcga attccgactc tgaatgcccg ctgtctcacg acggttactg cctacacgat120ggtgtttgca tgtatatcga agctctggac aaatacgcgt gcaactgtgt tgttggttac180atcggtgaac gttgccagta ccgtgacctg aaatggtggg aactgcgtta ataagcttgg240g241<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成
<400>3gataccatga aacaaagcac t 21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工合成<400>4cccaagctta ttaacgca 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>5agcacatcag caggacgca 19<210>6<211>15<212>PRT<213>人工合成<400>6Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu15 10 1权利要求
1.信号肽基因phoAspL10，它具有序列表中SEQ ID NO1所示序列。
2.分泌表达rhEGF的表达质粒pBL10EGF，其包含权利要求1所述的phoAspL10基因，及位于所述基因上游的温敏的启动子PL和位于所述基因下游的hEGF基因。
3.权利要求2所述表达质粒pBL10EGF转化的大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞。
4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于具有氨苄青霉素抗性。
5.工程菌株BE-2，所述工程菌株是从表达质粒pBL10EGF转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞筛选出的rhEGF分泌表达量最高的菌株。
6.信号肽基因phoAspL10和表达质粒pBL10EGF在制备直接分泌表达的rhEGF上的应用。
7.rhEGF的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)化学合成phoAspL10序列；(2)以pBLGlu2为起始质粒构建表达质粒pBL10EGF；(3)构建和筛选出基因工程菌株BE-2；(4)基因工程菌BE-2的发酵培养；(5)表达产物的分离纯化。
8.如权利要求7所述的制备方法，其中所述的发酵培养是先在30℃对工程菌株进行培养，然后再升温至38℃诱导rhEGF分泌表达的方法。
9.如权利要求7所述的制备方法，其中所述的分离纯化是采用超滤、疏水层析、阴离子交换和凝胶过滤的组合方式。
全文摘要
本发明提供信号肽基因phoAspL10、表达质粒pBL10EGF、用表达质粒pBL10EGF转化的大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞及从中筛选出的工程菌株BE－2。进一步提供制备rhEGF的方法，即化学合成全新设计的phoAspL10基因及其与hEGF的串联基因，并以pBLGlu2为起始质粒构建表达质粒pBL10EGF，进而构建工程菌株BE－2，该菌株经发酵培养，直接分泌表达rhEGF至培养基中，分泌表达量达到384mg/l，分离纯化后，产品纯度大于95％，比活性大于1.0×10
文档编号C07K1/00GK1854294SQ200510025289
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者甘人宝, 钱悦, 朱俊, 冯宝山, 丁红珍, 张倩, 叶勤, 张海毅 申请人:甘人宝, 钱悦, 朱俊, 冯宝山, 丁红珍, 张倩, 叶勤, 张海毅