专利名称：基于大肠杆菌的结核菌表达文库及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，涉及一种基于大肠杆菌的结核菌表达文库及其用途。
背景技术：
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，以下简称结核菌)一直是威胁人类健康的主要病原微生物之一，至今仍未完全未明了其致病机理。1998年对MTB H37Rv和CDC1551菌株全基因组测序工作的完成，使得对这种病原微生物的研究上了一个新的台阶，但从全基因组序列分析中得到的4000多个基因中，有16％的基因功能完全未知。了解这些基因的功能，将为深入研究MTB的致病机理给出新的线索，进而为新药物的开发提供可能的靶点。
结核分枝杆菌通过呼吸道入侵人体肺部时，面临诸多不利因素的胁迫，如缺氧、低pH值、肺部表面活性物质等。其中，肺部表面活性物质参与了对病源微生物入侵的免疫应答，并且使细菌面临表面活性物质的胁迫。研究与此相关分子机制，不仅能了解结核分枝杆菌在体内存活的机理，而且为消灭它们提供新的线索。
结核菌是乙类致病菌。研究该类致病菌需要较高的生物安全级别的实验室。这限制了常规实验室开展结核菌致病功能基因的研究，不利于加速揭示结核菌致病机理和开发新的控制结核病的措施。
发明内容
本发明的目的在于提供，1.一种基于大肠杆菌的结核菌表达文库；2.从文库中筛选功能基因的方法；3.利用从文库中筛选的基因作为药物靶标研发新的药物的模型。
本发明的技术方案如下我们通过功能驱动筛选方法，从含有MTB基因组文库的大肠杆菌中筛选出对SDS胁迫耐受的重组子，通过序列比对，发现一个以前功能未知的蛋白可能在耐受SDS胁迫中表现出一定功能。通过在大肠杆菌中的克隆，重组，诱导表达，获得了该蛋白的异源表达。序列分析发现该蛋白为可能的膜蛋白。膜蛋白在细菌的致病性上表现出重要的作用，为了研究该蛋白的功能，我们比较了重组菌和对照脂肪酸含量的差异，分析了它们粗提物对细胞生长的影响。为进一步了解MTB致病的分子机理打下基础。
实现上述目的的基本技术路线为总体技术方案是克隆包括提取结核菌基因组，利用合适的载体和限制性内切酶片段，构建转化载体，将基因组DNA克隆到合适的大肠杆菌宿主细胞。
1.基因模板提取将待克隆菌株在LB培养基或YE培养基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝杆菌能够生长的培养基中，培养到合适的菌体浓度，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法提取菌体DNA。
2.基因组表达文库的构建按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂和方法，将基因组DNA克隆到适当的载体，转化适当的宿主菌，通过一定的选择标记，收集获得的结核菌基因组表达文库。
3.功能基因的筛选 按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可以从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。分别根据已知的结核菌入侵人体和动物模型可能遭遇的不利环境，进行人工模拟，从基因组表达文库筛选相应的转化子，并进一步验证。
4.利用含有功能基因的重组菌，进行功能基因抑制剂或激活剂的筛选。
发明效果利用本技术方案涉及的方法，构建了一种基于大肠杆菌的结核菌表达文库并筛选到了与抗表面活性剂的结核菌功能基因Rv0621，纯化了重组Rv0621，利用该重组菌筛选调控抗表面活性剂的分子。
图1.结核分枝杆菌基因组不完全酶切结果。Sau 3AI浓度是0.003125 U/μgDNA，2.0.00625U/μgDNA，3.0.0125 U/μgDNA，4.0.025 U/μgDNA，5.0.05 U/μgDNA，6.0.1 U/μgDNA。
图2.在含有0.4％SDS平板上，大肠杆菌的生长情况。1.结核菌基因组表达文库；0，空载体转化的对照E.coli。
图3.酶切分析S1菌所含质粒箭头所指的地方为双酶切切下小片段。1.重组质粒2.分子量标记3.对照。
图4.菌总蛋白分析箭头所指的地方为表达差异蛋白。1.E.coli JM109/pUC18总蛋白；2.E.coli JM 109/pUC18-S1总蛋白；M.分子量标记。
图5.大肠杆菌BL21中重组表达Rv0621。1.重组Rv0621，2.未诱导，3.pET32a(+)-BL21(DE3)对照。
具体实施例方式
1.材料和方法1.1材料1.1.1菌株和质粒灭活的结核分枝杆菌耐药菌株580购自重庆市肺科医院，试验所用载体pUC18，pET32a(+)、大肠杆菌JM109，DH5a和BL21(DE3)、肺癌细胞株A549为本试验室保存。
1.1.2主要试剂和仪器各种限制性内切酶，小牛肠碱性磷酸酶CIAP，T4DNA连接酶，胶回收试剂盒购自大连宝生物(TaKaRa)公司；RNase，蛋白酶K，溶菌酶，氨苄青霉素，SDS为上海生工产品。fu DNA聚合酶，dNTP，IPTG购自北京鼎国生物技术有限公司。其它试剂为国产分析纯。引物由上海英俊公司合成，DNA测序由上海博亚生物技术有限公司完成。脂肪酸分析由Thermo的Trace GC ultr a Trace DSQ型号的气相色谱-质谱连用仪完成。
1.2培养基和培养条件大肠杆菌(Escherichia coli)JM109菌株用LB培养基，筛选平板由M9基本培养基加入0.4％SDS构成，氨苄青霉素(Amp)的使用终浓度为100μg/ml。培养温度均为37℃。
1.3 DNA的提取结核分枝杆菌耐药菌株总DNA的提取按文献[4]进行；质粒DNA的提取按文献[5]进行。
1.4结核分枝杆菌基因文库的构建选择合适的浓度Sau 3A I部分酶切MTB基因组，使切得的基因组片段大多数在1-6kb之间。以Bam H I完全酶切载体pUC18，用CIAP对酶切产物进行末端去磷酸化，然后与制备的结核基因组酶切片断进行连接反应，将连接产物转化大肠杆菌JM109，在含有Amp的LB平板上培养20h，长出的克隆保存于4℃保存。
1.5耐SDS大肠杆菌阳性克隆的筛选用牙签将上述平板上长出的菌落点种到含有Amp、0.1mMIPTG及0.4％SDS的M9筛选平板上，数量为100-150个/板，在37℃下培养20h，挑选能够生长的菌落。接入液体LB，摇菌8h(相当于传代28代)，再接M9筛选平板上，挑取能生长的菌落，20％甘油保种。
在以一系列逐渐升高的SDS梯度逐级筛选，最后选取能在含1.6％SDS的M9平板上生长的转化子，提取质粒重新转化大肠杆菌JM109。将能够生长的菌落质粒进行下一步分析。
1.6 DNA序列和蛋白序列分析DNA测序由上海博亚生物技术有限公司完成，通过GanBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行核酸序列的同源分析，通过ncbi中的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析测序结果中含有的ORF，以及重组蛋白的序列。用Tmpred分析重组蛋白的跨膜结构，signalP分析信号肽，Vector NTIsuite 9分析其分子量，等电点等。
1.7 Rv0621的重组表达依据ncbi中公布的Rv0621序列，设计引物P1 GTAGGATCCATGGCAGGCGATCGAG(划线碱基为Bam HI酶切位点)P2 CATGTCGACCGAACCCGTTCGAG(划线碱基为Sal I酶切位点)以MTB H37Rv基因组为模板，PCR反应条件为96℃ 5min；96℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 2min30s，35个循环；72℃ 10min用TaKaRa胶回收试剂盒切胶回收PCR产物。
以BamHI和SalI双酶切回收后的PCR产物以及质粒pET32a(+)，T4 DNA连接酶连接过夜，转化DH5α，通过菌落PCR以及重组质粒双酶切验证后，将重组质粒转化BL21，再次验证后，将E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-Rv0621及E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)接种于含有100μg/mL氨卞青霉素的LB培养基中，37℃培养。当OD600达到0.6左右时，加入IPTG(终浓度为1mmol/ml)，在30℃培养4h，收集菌体，SDS-PAGE分析。
1.8重组菌及对照脂肪酸分析将诱导后的重组菌以PBS清洗菌体，依据文献[6]进行脂肪酸提取。将处理好的样品进行GC-MS分析，条件为进样口温度250℃，50℃ 5min，以25℃/min升到250℃，保持7min；载气∶氩气；分流比100∶1；程序升温初温80℃，20℃/min升到210℃，再以3℃/min升到225℃，保持12min。离子源200℃，60-150m/z1.9与细胞相互作用分析将相同量的重组菌以及重组菌重旋于Tris-HCl pH8.0缓冲液中，超声破碎菌体，15000rpm离心，取上清，没有稀释的液体浓度设为1，每个梯度稀释四倍。共设八个梯度，在96孔板中，以每孔100μl的量处理相同量的细胞。3天后，以MTT法[7]测定活细胞量。
2.结果2.1 580基因文库的构建将Sau 3A I部分酶切的MTB580总DNA产物与Bam H I酶切后去磷酸化的pUC18载体连接，转化到大肠杆菌JM109中，共获得约3000个重组克隆。选用0.025 U/μgDNA的浓度酶切基因组。
2.2结核基因Rv0621的分离基于大肠杆菌JM109不能在含有0.4％的表面活性物质SDS上生长，首先挑选在0.4％SDS的M9培养基上生长的转化子，为了检测这些转化子性状是否稳定，将其转入液体LB培养基中，培养8h，在LB中大肠杆菌的代时为12.5-17min，由此推断，经过了至少28代的传代，再涂到筛选培养基上，有五个转化子仍然能够生长。对这些菌的质粒进行序列分析后，挑选一个含有结核基因Rv0621的转化子进行进一步分析。结核基因Rv0621是一个预测的功能未知的含有GTP或ATP结合位点的膜蛋白，在NCBI中序列比对结果发现，仅H37Rv，CDC1551以及BCG中有该基因存在，其它基因的Score都低于48.1 Bits(完全匹配有2111 Bits)。目前还没有发现关于该基因的任何报道。
2.3 Rv0621编码蛋白的序列分析结核基因Rv0621编码一个含354个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量37KD，等电点6.0，四次跨膜，经signalP分析，N端不含信号肽，含有GTP或ATP结合位点基序A(P环)结构为[AG]-x(4)-G-K-[ST].，筛选到的菌株中的重组蛋白含有开始跨膜前N端的所有序列。
2.4菌株S1总蛋白分析与空质粒对照相比，能在含0.4％SDS平板上生长的菌株S4与对照菌相比，在44.3KDa-29.0KDa以及29.0KDa处有明显新增蛋白条带。
2.5 Rv0621的重组表达经过IPTG诱导E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-Rv0621以可溶形式表达重组蛋白，分子量约66.4KDa，与预期分子量相符。
权利要求
1.一种基于大肠杆菌的结核菌表达文库，其特征是将结核菌基因组DNA酶切为适宜大小的片段后克隆到合适的大肠杆菌细胞，构建基于大肠杆菌的结核菌表达文库，利用该文库在普通实验室筛选结核菌功能基因。
2.权利要求1所述的功能基因是Rv0621。
3.权利要求1所述的功能基因Rv0621在抗表面活性剂中的运用。
4.含有功能基因是Rv0621的重组菌，重组宿主是大肠杆菌。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，构建了一种基于大肠杆菌的结核菌表达文库并筛选到了与抗表面活性剂的结核菌功能基因Rv0621，纯化了重组Rv0621，利用该重组菌筛选调控抗表面活性剂的分子。
文档编号C12R1/19GK1995351SQ20061009533
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者谢建平, 廖丹, 郭茹珍, 王洪海 申请人:西南大学