专利名称：：重组胎儿弯杆菌n端表面膜蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组蛋白，尤其涉及一种重组胎儿弯杆菌N端表面膜蛋白及其编码基因，本发明还涉及该重组胎儿弯杆菌N端表面膜蛋白在牛胎儿弯杆菌病血清学检测中的应用，属于动物疾病检验检疫领域。
背景技术：
：胎儿弯杆菌(Campylobacterfetus)属于弯杆菌属的成员，包括胎儿弯杆菌胎儿亚种(C.fetussubsp.fetus)和胎儿弯杆菌性病亚种(C.fetussubsp.venerealis)。自McFadyean等(1913)从流产绵羊的阴道分泌物中分离到弧菌样^t生物以来，国内外学者己对胎儿弯杆菌进行大量研究，发现胎儿弯杆菌呈世界性分布，是危害人或动物健康的重要病原微生物之一。胎儿弯杆菌叉称胎儿弧菌，是一种革兰氏阴性，一端或两端鞭毛，不形成芽孢或荚膜，"S，，状或螺旋状的小弯杆菌，但在老龄培养物中可呈球形或螺旋状长丝(由多个S形菌体形成的链)。胎儿弯杆菌胎儿亚种可引起牛羊的流产和不育，性病亚种专嗜牛的生殖道，破坏牛的胎盘，导致不孕；公牛感染后，症状不明显，但可以污染精液，通过配种或人工授精等造成胎儿弯杆菌性病亚种的传播。胎儿弯杆菌通过污染的水源、食物、精液、流产的胎儿和粪便等进行传播，非易感动物和鸟类可作为其感染的第二宿主。带菌公牛、感染母牛和康复母牛是主要的传染源。人，尤其患有免疫缺陷症的人，感染胎儿弯杆菌后能引起脑膜炎、菌血症、关节炎和腹泻等疾病。因此，胎儿弯杆菌严重威胁着人类的健康并给畜牧业造成重大经济损失。胎儿弯杆菌病的诊断方法有细菌学方法、分子生物学方法和免疫学方法等。目前，国内对于胎儿弯杆菌病的诊断方法主要依赖于生化实验，例如氧化酶实验(使用琼脂平板表面经24h培养的生长物〔也可取用于抗生素试验的平板〕，将氧化酶试剂滴于棉拭子上，并用棉拭子去接触表面生长物，在接触点出现深蓝色斑点者为阳性。)，硫化氢产生试验(将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部〔不让滤纸条接触培养基〕，旋紧试管帽，置空气中于37'C培养。每日检查,观察滤纸条是否变黑,纸条变黑表明有硫化氢产生,为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d,方可做出最后判断)以及1%甘氨酸生长试验等。病原分离是检测传染性疾病的常规方法，但是由于胎儿弯杆菌的生长需要严格的气体环境和生化条件，且对采集的病料有特殊要求，这给胎儿弯杆菌的分离带来很大困难。秦贞奎等(1987)建议用无菌的3.5%的02,10%的0)2，86.5。/。的N2来分离和培养胎儿弯杆菌。但一般的实验室不具这种条件，且不易操作。另夕卜，胎儿弯杆菌在合适的培养基上也生长緩慢，既便得到了可疑菌落，用生化试验来鉴定胎儿弯杆菌难度较大，因为其新陈代谢速度慢，适用的生化实验少，且有些生物中间型更不易区别。由于胎儿弯杆菌分离难度大，花费时间长，且有一定的主观性，不利于处理大量样品。因此，研究检测胎儿弯杆菌病的新方法，对于了解其在我国的分布和流行情况具有重要意义。随着分子生物学的不断发展，国外主要采用PCR方法，DNA指紋印迹，脉冲场凝胶电泳对胎儿弯杆菌进行分离鉴定。例如Oyofo等利用flaA基因保守区设计引物，用来检测空肠弯杆菌和大肠弯杆菌。实验结果表明:只有空肠弯杆菌和大肠弯杆菌的样品出现450bp扩增产物，而胎儿弯杆菌、螺旋体等微生物无特异性扩增产物。该聚合酶链式反应能纟企测到0.0062pg纯化的空肠弯杆菌或大肠弯杆菌的基因组DNA。这说明聚合酶链式反应在检测空肠弯杆菌或大肠弯杆菌时具有特异性和敏感性。Vargas等(2003)利用PCR技术对胎儿弯杆菌亚型的分型进行了研究，在其研究过程中运用脉冲场凝胶电泳技术，并应用树状图对其进行了分析。Re皿ie等用生化实验和药敏实验研究分离自感染人的血液和粪便胎儿弯杆菌的差异，并通过脉冲电场凝胶电泳得到胎儿弯杆菌基因组DNA酶切后的基因图谱来证实，这说明利用胎儿弯杆菌基因图谱来发现和检测其突变抹具有一定的意义。sloMasakiFujita等用内切酶Sa/I和SmaI分别酶切21林胎儿弯杆菌的基因组DNA,利用脉沖电场凝胶电泳获得它们的指紋图谱，然后分析各菌抹间的系统进化关系，为研究胎儿弯杆菌的流行病学提供了方便。也有利用PCR方法通过扩增16sRNA的方法来检测胎儿弯杆菌的研究。分子生物学方法虽然特异性和敏感性较高，但只适于实验室操作而不适于临床推广应用。血清学方法尤其是酶联免疫吸附试验(ELISA)方法在细菌疾病的检测中是经济，方便和省时省力的首选方法。Newsam等(1967)建立了利用特异性IgA进行的阴道粘液凝集实验，但这一方法只适用于群体检查，不能用于个体确诊。并且该法仅能检测出50%的感染动物。由于IgA抗体在感染后30-70天才开始出现，且抗体水平低，持续一段时间后，部分动物会出现抗体消失。SaeedAkhtar利用ELISA方法对来自加利福尼亚的630份牛血清进行检测，应用其数据来评定胎儿弯杆菌、睡眠嗜血菌和牛病毒性腹泻病毒等的血清学阳性率及阴性率。Brooks等利用自己研究的四个单克隆抗体与胎儿弯杆菌脂多糖核心抗原表位结合，以蛋白酶K消化和石,友酸水洗涂下来的脂多糖作为抗原，应用ELISA方法对四个单克隆抗体进行;险测。他们得出这些单克隆抗体对于胎儿弯杆菌具有;^艮高的特异性，可作为鉴定胎儿弯杆菌的潜在性免疫诊断试剂。胎儿弯杆菌野型菌抹表面覆盖有一层高分子量的表面蛋白，这层蛋白对胎儿弯杆菌的毒力起重要作用，其分子量约为97-149KDa,该表面蛋白在引起牛羊的流产等疾病中起了至关重要作用。在混合培养中，单一菌抹可以表达三种蛋白，但以其中一种占主导地位，其原因尚不十分清楚。有的自发突变抹缺失高分子量的表面蛋白后，对正常血清变得敏感。ShujiFujimoto等用冷冻蚀刻分析技术研究发现98KDa的表面蛋白呈六角形排列，中心距为24nm;127KDa和149KDa的表面蛋白呈四角形排列，中心距为8nm。事实表明高分子量的表面蛋白的保守，特别是氨基(N)端具有保守性，可能和它抵抗补体成分C3b与菌体相结合、排泄、自我组装和形成晶体结构等功能有关。由于表面蛋白抵抗补体成分C3b与菌体相结合，因此它具有抗血清、抗呑噬的作用。高分子量的表面蛋白由sap基因族编码，由I型分泌系统分泌和运输。sap基因族中sapA2基因，编码全长1109个氨基酸的表层蛋白，sapA2基因阅读框前的70个碱基及与其相连的阅读框中的550个碱基是保守的，并以完整的基因形式存在于基因组中。用sapA基因5'保守端作为探针对脉冲电场凝胶电泳后的凝胶进行Southern杂交，结果表明sap基因族紧密群聚于基因组中。由于胎儿弯杆菌8个紧密群聚的sap基因族的重组,其表达的高分子量的表面蛋白的抗原性不断发生变化，以逃避宿主的免疫杀伤作用。sap同位基因的重组伴随着一个6.2kb的sapA基因的含启动子序列的基因组件的倒置，或和一个甚至多个sap基因的侧翼序列一起倒置。这和sap基因侧翼序列的一致及其5，端含有相同识别序列有关。能促进同源碱基配对和单链DNA交换的RecA蛋白在sap基因族的重组中起到不可缺少的作用。Murali等研究发现，sapA基因启动子的缺失能导致高分子量表面蛋白的缺失。研究胎儿弯杆菌野型林拥有的高分子量的表面蛋白，对于进一步了解其致病机理，制造基因疫苗，控制胎儿弯杆菌的传播具有重要作用。Grogono-Thomas等人将胎儿弯杆菌97KDa的表面蛋白SapA纯化，皮下途径免疫该表面蛋白，发现表面蛋白是非常强的抗原，可以从奶，血清，胆汁及尿液中检测到抗体。研究人员从经胎儿弯杆菌表面蛋白(97KD)免疫过的2只兔体内找到位于表面蛋白N末端保守区第184个氨基酸多肽结合的IgG抗体，其中被鉴定的2个假定的抗原表位位于氨基酸81到110和141到160之间。胎儿弯杆菌J05577抹表面蛋白全基因sapA由3974个碱基组成，其开放阅读框架为2820个碱基，所表达的蛋白约为97KDa，与上述所说保守区域的免疫保护效果较好的蛋白位置相符，这就更说明表面蛋白是一种较好的血清学检测抗原。另夕卜，Wang等学者研究发现胎儿弯杆菌表面蛋白具有多个抗原表位和较强的致病作用。在感染动物体内表达的占主导地位的表面蛋白的大小和类晶体结构不断发生变化，从而导致其相应抗体的不断变化。目前，国内还没有关于牛胎儿弯杆菌表面蛋白的研究报道，更没有应用ELISA方法检测牛胎儿弯杆菌病的研究，故本发明应用胎儿弯杆菌表面蛋白作为抗原建立间接ELISA诊断方法，以达到对胎儿弯杆菌病的快速特异的诊断。但由于胎儿弯杆菌表面蛋白基因片段较长，全基因表达困难和产量过低，不符合作为诊断抗原的要求。
发明内容本发明目的之一是提供一种可作为胎儿弯杆菌病诊断抗原的重组蛋白；本发明目的之二是提供编码上述重组蛋白的基因。本发明目的之三是提供一种制备上述重组蛋白的方法。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的可作为胎儿弯杆菌病诊断抗原的重组胎儿弯杆菌N端表面膜蛋白，其为SEQIDN0:2所示的氨基酸序列。编码上述重组胎儿弯杆菌N端表面膜蛋白的基因，其碱基序列为SEQIDNO:l所示。一种制备上述重组胎儿弯杆菌N端表面膜蛋白的方法，包括(1)、从胎儿弯杆菌(Campylobacterfetus)菌林中提取基因组DNA;(2)、以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的碱基序列为引物，以步骤(1)所制备的基因组DNA为模板进行PCR扩增；(3)、将步骤(2)所扩增得到的基因片段连接于表达载体中，得到重组表达载体；(4)将重组表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达；收集、纯化所表达的蛋白，即得。上述方法中，其中，步骤(3)中所述的表达载体优选为pET22b、pET30a、pGEX-6p-l或pET32a(+)载体，更优选为pET32a(+);所述的重组表达载体优选是pET32-sapA-N;步骤(4)中所述的纯化蛋白的方法优选为金属鳌合层析的方法。本发明对位于胎儿弯杆菌表面蛋白N端1398bp的基因进行了表达，所表达的可溶性蛋白(rSapA-N)经过金属鳌合层析的方法纯化，得到约66KD大小的蛋白，经过ELISA检测和Westernblot分析，发现该蛋白具有很好的免疫活性；将本发明表达的蛋白质作为抗原，可用间接ELISA试验方法检测胎儿弯杆菌病，检测结果说明该抗原具有很高的特异性和敏感性，可用于胎儿弯杆菌病的血清学诊断。图1sapA-N基因的PCR扩增结果；1sapA-NPCR产物；2,MarkerDL2000。图2pET-sapA-N重组质粒的酶切鉴定；1pET-sap-N质粒的酶切；2DL15000DNAMarkcr。图3重组质粒的蛋白表达；1,2pET-sap-N细菌裂解上清,3，4sap-N细菌裂解沉淀；5,6pET32a载体对照；蛋白质分子量marker。图4重组rSap-N蛋白的Westernblotting结果；1:蛋白质Marker;2:表达蛋白rSap-N。具体实施例方式以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1编码胎儿弯杆菌N端(sapA-N)表面蛋白DNA的制备sapA-N基因(1398bp)的PCR扩增胎儿弯杆菌553抹(吉林出入境检验检疫局)基因组lul,引物sapA-N-U和sapA-N-L各0.5ul(sapA-N曙U5'GAATTCGCAAGTGAGGGTGATGGT3'(SEQIDNO:3);sapA-N-L5'AAGTCGACAACCTTAGCAGCAGCTC3，(SEQIDNO:4))引物浓lOpMol,10xTaqDNA聚合酶Buffer2.5ul、2mMdNTP1.5ul、TaqDNA聚合酶0.5ul，以水补足，反应体系为25ul，然后进行PCR扩增。PCR反应的条件为95。C变性10分钟，94。C变性1.5分钟，55。C退火1.5分钟，72。C延伸1.5分钟，30个循环，72。C延伸10分钟。在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，100V电压20分钟后观察结果。然后用胶回收试剂盒进行sapA-N基因的回收。结果，PCR扩增出1389bp的DNA片段(图1)，与实际大小相符。实施例2编码胎儿弯杆菌N端(sapA-N)表面蛋白基因的分子克隆、表达和纯化.sapA-N基因的分子克隆先将上述Taq酶扩增的sapA-N基因连接pMD18T-Vector,转化DH5a感受态细月包，获得重组质粒pMD18T-sapA-N。经酶切和PCR鉴定的重组质粒，用￡coiI和Sa/I切下并胶回收sapA-N基因，将它们分别连入经酶切处理的pET32a(+)的相应位点，转化DH5a感受态细胞，酶切和PCR鉴定后获得重组质粒pET32-sapA-N。结果经过酶切鉴定(如图2所示)，表明已经成功构建含有目的基因的重组表达载体，经过IPTG诱导进行了表达(如图3所示)，表达的重组蛋白(rSapA-N)与实际设计的大小相符。将IPTG诱导后的菌液经过离心、洗涂后进行超声波裂解，高速离心后收集上清液，应用亲和层析柱进行纯化，测定纯化后的蛋白浓度为2.964mg/ml。纯化后的rSapA-N置于-7(TC保存。纯化后的rSapA-N的Westernblotting结果见图4。试验例1本发明抗原蛋白的诊断效果试验一、试验材料1、供试样品用本发明实施例2所纯化的蛋白质作为包被抗原。2、阳性对照、阴性对照由本实验室保存。空白对照为100|il底物溶液加50nl终止液。3、试剂明胶、吐温20、TMB(邻苯二胺)。二、试^睑方法将本发明实施例2所表达的蛋白纯化后，所纯化的蛋白可以作为ELISA的诊断抗原，用于临床样品的检测，能够达到预期的诊断效果。ELISA检测程序1、将纯化后的抗原用pH9.5的碳酸盐緩冲液稀释后进行包被ELISA板(Nunco公司)，50pl/孔，室温过夜；2、次日厄掉液体，力。1%明胶(Sigma)进行封闭，150^1/孔37。C湿盒lh;3、取出后甩掉液体，用pH7.6的PBST洗涤3次，300^1/孔每次3min;4、加用PBST稀释后的待检血清，50pl/孔37。C湿盒lh,同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照；5、取出后甩掉液体，用pH7.6的PBST洗涤3次，300^1/孔每次3min;6、加用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗牛的二抗(Sigma公司)，50^1/孔，37X:湿盒lh;7、取出后甩掉液体，用pH7.6的PBST洗涤4次，300^1/孔每次3min;8、加底物TMB5(Hil/孔，避光室温放置10min显色；9、力。50nl/孔2MH2S04终止反应，450nm测定OD值。10、结果判定OD>0.45为阳性，OD<0.45为阴性。试验结果见表1表lELISA检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>说明供试样品的数值结果大于等于0.45为阳性结果表明采用本发明表达的蛋白质作为抗原，可用间接ELISA试验方法检测胎儿弯杆菌病，检测结果说明该抗原具有很高的特异性和敏感性，可用于胎儿弯杆菌病的血清学i貪断。序列表<110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>重组胎儿弯杆菌N端表面膜蛋白及其编码基因和应用<130>PKL0878<160〉4<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>1389<212〉DNA<213〉Campylobacterfetus<400>1atgttaaacattcaatgctttatatcactattatggg城ggc幼gtgag60ggtgatggtaataagtat"tggttagattatatagtttaggagtttcaagt120ttagct3atattatgcttgatagtccaggggcggctaaattctttggtgattctctttta180gc3ggtaBtg犯犯agattttgttactaagatatatagtatagcttt鄉taatactagt240gatgttgatggcattaattattggactaaggcaataactggcggtggagaatttactgat300agt犯gggtaatgttattagtgttgctagtttaBgcaagggtgatttaataggtgctatg360attaactctatggUaatggcggtagtgctgagtctaaggcta/tat"ttgeiggctaaggca420gctgctagtgattactttgccgatgctactttggt犯gggatattagtggattaga/tgag480ggtactacttctaagttaattagcgagattaatagtgcteigtgatcttgataaggttaag540agtgagattgatgctttgaagagtgagctacct犯tccgggtagtacttatgatcttaca600gagggtaatgataatttaaagggtactgatttagacgatacttttaatgggactacatat660gtaggtaatggtactaataagagtactcttagtgcatttgataagartagatggtcggtg720cUggg鄉gatacgttgaatgcgatatttactgcaataacacgcgctgcgctactaact780gatcaagctgcactaaaaggcgtacaaacgtagaaaatatcaatataatt840tcagatctagaaacaagtggcgatttcgttttcaacggtt■gtacttggcgctttgctaccgacgcatctaaaagcgtaaatgtagaaaca960ac3gg肌cgataactgctttcaccgcagccgg幼caggc3犯gtcgatgttgtcgccggt1020aaaatctctgcccttacggccgattcgcgaacaagcgtaaatttaactgctacaaacgac1080actatcacattaaccagtgcaaacgctgctactagtgtgaatttaaaacagCggC6LggCC1140aaagacgctacaataacatccgcaa/tgcagcaa幼atataacaatagacgcaacaggatt1200gcaactataacttcagctacggctgtagagaatttgacagttaaacatgc1260gcgctaaatggtggcatggataaacttgcaacagttactcttgac幼tgctgctttaact1320gctgcaatagatataaaatctgcaagcacact幼atttaataaattcaagtgtt犯cgga1380ccaaaacat1389<210>2<211>463<212〉PRT<213>Campylobacterfetus<400>2MetLeuAsnLysThrAspValSerMetLeuTyrlieThrlieMetGly1015MetAlaSerGluGlyAspGlyAsnLysTyrTrpLeuAspTyrAlaAsn202530AsnAsnSerI>euGlyValSerSerLeuAlaAsnlieMetLeuAspSer354045ProGlyAlaAlaLysPhePheGlyAspSerLeuLeuAlaGlyAsnGlu505560LysAspPheValThrLyslieTyrSerlieAlaLeuGlyAsnThrSer65707580AspValAspGlylieAsnTyrTrpThrLysAlalieThrGlyGlyGly859095GluPheThrA印SerLysGlyAsnVallieSerValAlaSerLeuSer100105110LysGlyAspLeulieGlyAlaMetlieAsnSerMetValAsnGlyGly115120125SerAlaGluSerLysAlaliePheGluAlaLysAlaAlaAlaSerAsp130135140TyrPheAlaAspAlaThrLeuValArgAsplieSerGlyLeuAspGlu145150155160GlyThrThrSerLysLeulieSerGlulieAsnSerAlaSerAspLeu165170175AspLysValLysSerGlulieAspAlaLeuLysSerGluLeuProAsn180185190ProGlySerThrTyrAspLeuThrGluGlyAsnAspAsnLeuLysGly195加O205ThrA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