专利名称：一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程重组蛋白，具体地说是一种无标签结核融合蛋白 ESAT6-Ag85B，属于疫苗制造技术领域。
背景技术：
结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一，全世界仍有近1/3的人感染过结核分枝杆菌，大约有5%的结核感染者在2-5年内会发展为肺结核病人，其余的有可能会形成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一，每年约有13万人因结核病而死亡。目前，卡介苗(BCG)的接种是有效预防结核病的重要措施。然而，不同研究显示， BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80%不等。因此，研制和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。可供研究的抗结核疫苗有亚单位疫苗，重组BCG，减毒的结核分枝杆菌(MTB)活疫苗。亚单位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明确，使用安全等优点，相对易于被人们接受。大量研究表明，与单个抗原相比，融合抗原的免疫原性会增强，显示出更好的保护效果；因此受到国内外研究的重视。然而在以往的研究中，为了后期简便的纯化方法，往往构建成带有各种标签(如His · Tag, GST · Tag, S · Tag等)形式的融合蛋白，却未考虑这种融合蛋白所带有的标签是否会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的认可。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述为了后期简便的纯化方法，而构建带有各种标签形式的融合蛋白问题，本发明通过基因重组、表达方法，提供了一种不带有标签的结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B，为预防和控制结核病提供有效的亚单位疫苗。结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT6，具有多个T细胞、B细胞表位，是抗结核免疫反应的主要配体，有较强的免疫原性和免疫反应性，ESAT6能成为检测MTB抗体的特异性抗原，其优势是能区分MTB自然感染和BCG接种以及非致病性分枝杆菌感染后产生的抗体。另外，Ag85复合物(Ag85A、Ag85B 和 Ag85C)是牛分枝杆菌(M. bovis)、BCG 及 MTB 培养滤液中的主要分泌性蛋白，该复合物属于分枝菌酸转移酶，在结核分枝杆菌细胞壁合成的晚期起关键作用。其中，Ag85B导致的细胞免疫反应最强，可诱导实验动物产生特异性 Thl型细胞免疫应答，是抗结核免疫中的主要保护性抗原，表明Ag85B是机体重要的保护性靶抗原。本发明的技术方案为
一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，由以下步骤制备而成
(1)将结核分枝杆菌的基因ESAT6和Ag85B进行重组融合，构建重组质粒；
(2)将上述步骤(1)中制备的质粒进行转化，挑选阳性克隆进行诱导表达，获得重组基
3因的表达物；
(3)对上述步骤(2)中的重组基因表达物进行纯化。所述的步骤(1)的重组质粒的构建方法为根据GenBank中H37Rv中的ESAT6和 Ag85B的基因序列，应用分子克隆技术设计含有不同酶切位点的ESAT6引物和Ag85B引物， 以H37RV-DNA为模板PCR扩增出相应大小的基因片段，通过双酶切和T4连接酶的作用将扩增的基因片段连接，将连接产物转化入大肠杆菌克隆载体。所述的连接产物转化入大肠杆菌克隆载体后，挑选阳性克隆进行PCR验证并测序，测序结果见SEQ ID NO :1，测序正确的重组质粒再次转化入大肠杆菌表达载体。PCR扩增获得的ESAT6和Ag85B序列与GenBank中完全一致，二者融合后在大肠杆菌中表达产物大小约38KD，与预计大小相吻合。所述的步骤(2)的诱导表达方法为将步骤(1)中获得的含有重组质粒的表达载体接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，35 40°C振荡培养10 14小时；再将Iml的该菌液移入IOOml的LB液体培养基中，35 40°C振荡培养2 4小时，至吸光度A600值为 0. 6 0. 8，诱导振荡培养6 他后，离心，收集菌体。所述的步骤(3)融合基因以包涵体的形式表达，首先将其包涵体溶于8M尿素，然后在4°C进行梯度透析复性再采用离子交换层析和疏水层析的两种色谱分析方法进行最终的蛋白纯化。本发明的优点在于利用基因工程技术，克隆构建了不带有任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B，解决了融合蛋白所带有的标签会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的后续问题，并且通过利用不同的色谱分析方法使融合蛋白得到了有效的纯化，有望成为结核病预防的候选疫苗。
图1结核分枝杆菌基因ESAT6与Ag85B体外扩增图谱； 图2重组质粒pET30a-ESAT6的PCR鉴定图谱；
图3重组质粒pET30a-ESAT6与基因Ag85B的连接图谱； 图4融合基因ESAT6-Ag85B的表达结果图谱；
图5无标签结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B第一步纯化即离子交换层析图； 图6无标签结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B第二步纯化即疏水层析图； 图7无标签结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B的纯化结果图谱； 图3中1双酶切以及纯化的基因Ag85B、2双酶切以及纯化的质粒pET30a-ESAT6、3未酶切的质粒 pET30a-ESAT6、M Marker ；
图4中1 Marker,2 BL21空菌上清、3 BL21空菌沉淀、4 ESAT6_Ag85B上清、5 ESAT6-Ag85B 沉淀；
图7中1 Marker,2纯化前的ESAT6_Ag85B、3第一步纯化后的ESAT6_Ag85B、4第二步纯化后的ESAT6-Ag85B ；
SEQ ID N0:1:融合基因ESAT6-Ag85B的DNA测序结果(注GAATTC为EcoR I的酶切位点)。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例一
重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B的克隆构建；
1、主要材料结核分枝杆菌株H37Rv来自甘肃省疾病控制中心；质粒pET30a、Ε. coli DH5a与BL21(DE3)由复旦大学王洪海教授惠赠；引物由上海生物生工工程有限公司合成； 基因测序由北京华大基因科技完成；PCR试剂盒、产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自大连宝生物有限公司；基因组提取试剂盒、DNA Marker III购自兰州市鹏程生物有限公司；质粒提取试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶I ,Η η lll,Nde I购自上海生物生工工程有限公司。2、主要仪器高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);超低温冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超纯水机AFZ0502U (重庆颐洋科技有限公司)；超净工作台(苏州净化)；东盛龙PCR仪；DYY12电泳仪及水平电泳槽(北京六一仪器厂)；IF258全自动凝胶成像分析系统(上海嘉鹏科技有限公司)；电子天平BT124S ；电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Beckman低温高速离心机 (USA) ； JB3型定时恒温磁力搅拌器(上海雷磁新径仪器有限公司)；PH仪(PB-16) ；DK80电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司)
3、重组质粒pET30a-ESAT6-Ag85B的克隆构建方法
根据GenBank中H37Rv中的ESAT6和Ag85B的基因序列，设计4对引物，分别为ESAT6 上游引物(Es)含酶切位点Mfe I及起始密码子；ESAT6下游引物(Ea)含酶切位点I ； Ag85B上游引物(85Bs)含酶切位点I ；Ag85B下游引物(85Ba)含酶切位点Η η III及终止密码子。以提取的H37Rv-DNA为模板，PCR扩增的ESAT6基因和858bp的Ag85B 基因(见图1)。ESAT6基因的PCR条件为98°C变性10 s，61°C退火15 s，72°C聚合30 s,共 30个循环。Ag85B基因的PCR条件为98°C变性10 s，62°C退火15 s，72°C聚合30 s,共30 个循环。Nde I ,EcoR I双酶切并纯化后的ESAT6基因和质粒pET30a，在"Γ4连接酶的作用下将两者进行连接，转化入E. coli DH5a中。PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)见图2。即保存菌种为pET30a-ESAT6 (DH5 a )。提取以上鉴定正确的重组质粒pET30a_ESAT6。^coR I和历/ d III双酶切Ag85B基因和重组质粒pET30a-ESAT6，分别纯化后用T4连接酶进行连接，转化入E. coli DH5 α (见图3)。PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)。即保存菌种为 pET30a-ESAT6-Ag85B (DH5a)。实施例二
融合基因ESAT6-Ag85B的诱导表达
1、主要材料低分子量蛋白Marker购自大连宝生物有限公司；卡那霉素、LB培养基成分(胰蛋白胨、氯化钠、酵母提取物)及蛋白电泳相关试剂(丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 Tris、过硫酸铵、甘氨酸、SDS、TEMED, β巯基乙醇、G250等)、磷酸氢二钠与磷酸二氢钠等试剂均购自兰州市鹏程生物有限公司；IPTG购自上海生物生工工程有限公司。
2、主要仪器高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司);超低温冰箱-80°C (USA 813283-1048)；艾科浦超纯水机AFZ0502U (重庆颐洋科技有限公司)；超净工作台(苏州净化);DYY12电泳仪及垂直电泳槽(北京六一仪器厂);IF258全自动凝胶成像分析系统(上海嘉鹏科技有限公司);电子天平BT124S;电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；Beckman低温高速离心机(USA) ； JB3型定时恒温磁力搅拌器(上海雷磁新径仪器有限公司);PH仪(PB-16)；脱色摇床TS-I (海门市麒麟医用仪器厂)；恒温振荡器IS-RDVl ；超声波细胞破碎仪(宁波新芝)。3、融合基因ESAT6_Ag85B的诱导表达方法
(I)WE. coli pET30a-ESAT6"Ag85B (DH5 α )提取重组质粒 pET30a-ESAT6_Ag85B，转化入E. coli BL2KDE3)中，PCR验证筛选阳性克隆进行测序鉴定(北京华大基因科技完成测序)。即为保存菌种为pET30a-ESAT6-Ag85B (BL21)。(2)将菌种 pET30a-ESAT6-Ag85B (BL21) 10 μ 1 接入含有 50 μ g/ ml 卡那霉素的5ml的LB液体培养基中，37 °C振荡培养约12小时；再将Iml的该菌液移入IOOml的LB 液体培养基中(含有50 yg/ ml卡那霉素)，37 °C振荡培养约3小时，至A600值为0. 6 0. 8，加入IPTG至终浓度为0. lmmol/ L，18 °C诱导振荡培养6 8h后，将菌液4°C离心， 10，OOOrpmX 20min 收集菌体。(3)将上述菌体按照5ml/g重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴条件下超声破碎细菌 40mirTlh左右(200W，超声 停2s)，4°C，10，OOOrpm离心20min后，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(注将大肠杆菌BL21同等条件下诱导表达作为阴性对照)。(4)经SDS-PAGE分析，与对照BL21空菌相比，分子量在38KD左右有明显的特异蛋白表达条带，以包涵体形式表达为主，上清中蛋白很少(见图4)。实施例三
融合蛋白ESAT6-Ag85B的纯化步骤
1、主要材料低分子量蛋白Marker购自大连宝生物有限公司；蛋白电泳相关试剂(丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris、过硫酸铵、甘氨酸、SDS、TEMED, β巯基乙醇、G250等)、 尿素、磷酸氢二钠与磷酸二氢钠、MW8000-14000透析袋等均购自兰州市鹏程生物有限公司； IPTG购自上海生物生工工程有限公司。2、主要仪器纯化仪(ΑΚΤΑ purifierTM UPC100 Sweden) ；DYY12 电泳仪及垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；脱色摇床TS-I (海门市麒麟医用仪器厂)；IF258全自动凝胶成像分析系统(上海嘉鹏科技有限公司)；PH仪(PB-16)；滤器及0. 45 μ m滤膜；酶标仪；离子交换柱(DEAE)；疏水层析柱(Butyl FF)03、配制以下缓冲液I 液 20mM PB (ρΗ7· 4) ； II液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4) ；III 液 20mM PB+2 M NaCl (ρΗ7· 4)。4、按上述表达步骤进行大量表达融合蛋白ESAT6_Ag85B，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎40min Ih左右，4°C，10，OOOrpm离心20min离心后收集沉淀， 溶解于8M尿素中。5、预先处理透析袋(MW8000-14000)，配制含5mM Tris-Cl, pH8. 0的尿素梯度复性液(6M尿素，4M尿素，2M尿素，IM尿素，0. 5M尿素，0 M尿素)各5000ml，4 °C下将蛋白 ESAT6-Ag85B依次用每个梯度透析1 来复性。
6、收集复性后的蛋白，用0.45μπι滤器过滤；酶标仪测定蛋白浓度(mg/ml )，根据所选层析柱的载量，计算确定蛋白的上样量。7、第一步纯化离子交换层析。选用弱阴离子交换柱DEAE进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE分析得初步纯化物。具体步骤如下⑴用5-10个柱体积的起始缓冲液A液即I液平衡分离柱，或直到基线，pH及电导稳定后。⑵将样品调整至I液的起始 PH和离子强度，并加载至分离柱。⑶用5-10个柱体积的A液(I液)冲洗分离柱，或直到基线，PH及电导稳定，即所有未结合物质均被冲洗出分离柱。⑷用10-20个柱体积的梯度进行洗脱，离子强度逐渐增加(0%B-100%B，注B液为II液)，直至目的蛋白被洗脱下来。收集不同的洗脱成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图5和图7)。8、第二步纯化疏水层析。经过离子交换层析初步纯化后的蛋白，加入等体积的III 液，使蛋白含高盐上柱。选用Butyl FF柱进行纯化，收集不同梯度洗脱液进行SDS-PAGE 分析得最终纯化物。具体步骤如下⑴用5-10个柱体积的起始缓冲液A液即II液来平衡柱子，或直到紫外吸光回到基线，电导平衡。⑵调节样品到选择的A液的盐浓度和pH。过滤， 上样到柱子上。⑶用5-10个柱体积的A液冲洗或直到紫外吸光回到基线，电导平衡，此时所有的未结合的蛋白被从柱子上洗脱掉。⑷用10-20个柱体积开始洗脱，增加B液(I液) 的比例，直到盐浓度达到最低，就是无盐缓冲液(100%的B液)。收集不同的洗脱成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(见图6和图7)。9、最后，将最终得到的蛋白纯化产物冻存待用。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，其特征在于由以下步骤制备而成(1)将结核分枝杆菌的基因ESAT6和Ag85B进行重组融合，构建重组质粒；(2)将上述步骤(1)中制备的质粒进行转化，挑选阳性克隆进行诱导表达，获得重组基因的表达物；(3)对上述步骤(2)中的重组基因表达物进行纯化。
2.根据权利要求1所述的一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，其特征在于所述的步骤(1)的重组质粒的构建方法为根据GenBank中H37Rv中的ESAT6和Ag85B的基因序列，应用分子克隆技术设计含有不同酶切位点的ESAT6引物和Ag85B引物，以H37Rv_DNA为模板PCR扩增出相应大小的基因片段，通过双酶切和T4连接酶的作用将扩增的基因片段连接，将连接产物转化入大肠杆菌克隆载体。
3.根据权利要求2所述的一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，其特征在于所述的连接产物转化入大肠杆菌克隆载体后，挑选阳性克隆进行PCR验证并测序，测序正确的重组质粒再次转化入大肠杆菌表达载体。
4.根据权利要求1所述的一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，其特征在于所述的步骤(2)的诱导表达方法为将步骤(1)中获得的含有重组质粒的菌种接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，35 40°C振荡培养10 14小时；再将Iml的该菌液移入IOOml的LB 液体培养基中，35 40°C振荡培养2 4小时，至吸光度A600值为0. 6 0. 8，诱导振荡培养6 后，离心，收集菌体。
5.根据权利要求1所述的一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，其特征在于所述的步骤(3)采用离子交换层析和疏水层析的两种色谱分析方法进行最终的蛋白纯化。
6.根据权利要求1所述的一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，其特征在于作为用于制备结核病疫苗的抗原。
全文摘要
本发明涉及一种无标签结核融合蛋白ESAT6-Ag85B，利用基因工程技术，将结核分枝杆菌的基因ESAT6和Ag85B进行重组融合，构建重组质粒，进行诱导表达，获得重组基因的表达物，最后将重组基因表达物进行纯化，克隆构建了不带有任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-Ag85B。本发明的优点在于解决了融合蛋白所带有的标签会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的后续问题，并且通过利用不同的色谱分析方法使融合蛋白得到了有效的纯化，有望成为结核病预防的候选疫苗。
文档编号A61K39/04GK102453096SQ20101052854
公开日2012年5月16日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者万艳, 唐克峰, 张颖, 李小娟, 王秉翔, 祝秉东, 章国平, 胡丽娜, 达泽蛟 申请人:兰州大学