一种Rv2645蛋白的制备及其在结核诊断与重组BCG疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Rv2645蛋白的制备及其在结核诊断与重组BCG疫苗中的应用。本发明发现结核基因RD10-14区的Rv2645蛋白不仅具有诱导产生高水平的γ干扰素的能力，而且用于结核病人血清抗体诊断特别是IgG4亚型的抗体诊断时与健康人群具有显著的统计学差异。Rv2645蛋白作为结核分枝杆菌的优势抗原具有诱导产生高水平细胞免疫及体液免疫的功能，其可作为结核病的新型诊断试剂；也可用于结核病新型重组BCG疫苗或蛋白疫苗，构建的能表达Rv2645蛋白的重组BCG具有抗结核免疫保护作用。本发明证实了Rv2645蛋白在用于结核病诊断及重组BCG疫苗时具有潜在的应用价值，将具有重要的经济效益。
【专利说明】-种Rv2645蛋白的制备及其在结核诊断与重组BCG疫苗中 的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子微生物学和感染免疫学领域，涉及一种RV2645蛋白的制备及其 在结核诊断与重组BCG疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002] 结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, M. tb)导致的结核病 (Tuberculosis，TB)是一种流行广、危害大的传染病，与艾滋病、疟疾并称为世界三大传染 病。全球有三分之一的人感染过结核病，每年死于结核病者有170多万人，为防治TB耗去 大量人力、物力。
[0003] 长期以来，结核病的诊断依赖于结核菌素皮肤实验，但是这种方法不能用于区分 结核病患者及接种过结核疫苗BCG的健康人。痰培养虽然是结核诊断的金标准，但是其 培养周期长，至少需要一个星期获取结果，而且该实验必须在严格的生物安全实验室里 进行。痰涂片的抗酸染色虽然简单易行，但是其灵敏度低（约34%检出率）。唯一获准 用于预防结核病、并广泛使用的疫苗是减毒的牛分枝杆菌制备的卡介苗（BCG，bacillus Calmette-Gue' rin)。多年实践表明，BCG仅对儿童有一定保护作用，对成年人保护效果差 异很大，其预防作用从0%?80%不等，这一传统疫苗的效果受到严峻挑战。BCG是从20世 纪60年代开始通过培养的方法进行传代和保存的。反复传代使BCG -些重要的免疫保护性 抗原基因发生变化，当年有效预防肺结核的BCG菌株已不复存在。Behr等（Behr MA，Wilson MA, Anderson P, et al. Comparative genomic of BCG vaccines by whole genome DNA microarray [J]. Sciernce, 1996, 284(541) :1520-1523)用基因芯片技术发现 BCG 较 M. tb 缺失了 RDl_RD16(regions of difference,!?)这16个基因区域。近年来许多研究报道显 示，恰恰是这些丢失区域所表达的蛋白具有很强的免疫原性。譬如，RDl区基因中广为报道 的丢失基因ESAT-6,该基因所表达蛋白已被证实具有很强的免疫原性。后续的研究证实， 通过电转技术将ESAT-6基因插入BCG基因组后能增强免疫保护作用，这一研究已发表在 Nature(Pym AS,Brodin P, Mailessi L, et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6confers enhanced protection against tuberculosis. Nature, 2003, 5, 9 (5) : 533-9.)上。但该石开 究仅限于RDl区，其他RD区可能亦存在类似于ESAT-6或更强于ESAT-6的优势抗原。但由 于RD1-16基因数众多，使得该研究较为困难。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于筛选并制备出结核杆菌RD10-14区中的优势抗原蛋白。
[0005] 本发明的第二目的在于评价筛选出的RD13区的优势目的抗原Rv2645蛋白在结核 病诊断中的应用价值。通过ELISA抗体夹心法，检测健康人与结核病人在Rv2645抗原特异 性抗体IgG、IgM、IgG2、IgG4上的差异。进一步筛选出Rv2645用于结核病临床诊断时最具 特异性的抗体亚型。
[0006] 本发明的第三目的在于评价优势目的抗原Rv2645在结核病疫苗研究中的潜力及 应用价值，特别是用于重组BCG的抗结核保护性效果。
[0007] 为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
[0008] 本发明研究内容是采用经典分子生物克隆技术，从GenBank中查RD区（RD10-14) 基因序列，设计引物并从M. tb菌株H37Rv (ATCC 25618)基因组中PCR得到RD区PCR产物， 将PCR产物构建到His标签的原核表达载体pET28a (Invitrogen)上，重组成功的质粒转化 蛋白表达工程菌大肠杆菌-BL21 (Invitrogen)，利用IPTG (异丙基硫代半乳糖苷）诱导及 Ni-NTA (琼脂糖-镍珠）亲和纯化获取表达纯化蛋白，并通过BSA (牛血清蛋白）制作标准 曲线的Bradford方法测量各纯化蛋白的浓度。
[0009] 首先将灭活的H37Rv菌株尾静脉注射BABL/c小鼠，预免疫小鼠7天，免疫结束7 天后取脾脏细胞，将纯化的H37Rv菌株RD蛋白分别刺激经免疫过的小鼠脾脏细胞，利用 ELISP0T (酶联免疫斑点法）检测其INF-Y释放水平。此外，RD蛋白刺激结核病人PBMC(夕卜 周血单个核细胞）释放的IFN-Y水平通过ELISA (酶联免疫吸附试验）检测。综合小鼠和 人的检测结果，评估刺激INF-Y释放产生较高水平的RD蛋白。将此RD蛋白包被96孔板 利用经典的ELISA法检测其在结核病人中的抗体水平。上述实验结果发现Rv2645不仅在 IFN- Y释放水平中最高，而且在24位结核病人与24位健康人血清IgG及IgM抗体检测中 表现出的统计学差异最大。为了进一步证实该Rv2645蛋白在结核诊断中的用途和价值，大 量制备并纯化Rv2645蛋白，将检测样本量增加到104位结核病人及104例健康人，检测的 抗体类型包括IgG、IgM、IgG2、IgG4,同时加入已有报道能用于诊断的CFP-IO与ESAT6的 融合蛋白即CE蛋白作为阳性对照。对实验数据经过SPASS软件进行分析，发现CE蛋白在 IgG、IgM及IgG4此三项指标在结核病人和健康人中的统计学差异均较Rv2645的小。且 Rv2645的结核病人及健康人血清IgG2检测结果亦具有差异统计学意义，而CE蛋白无IgG2 的差异。因而证明Rv2645在血清学结核诊断的应用价值高于已有报道的CE蛋白。
[0010] 本发明的一系列的研究证明RV2645具有较强免疫原性，本研究进一步构建重组 表达Rv2645蛋白的重组BCG结核疫苗。将Rv2645基因构建至穿梭质粒pMV361 (Biovector Science Lab，Inc)上，通过电转技术将重组质粒pMV361-Rv2645转入BCG(ATCC 35734)感 受态中，通过卡那抗性筛选、PCR、Western-blot (免疫印迹实验）、Southern blot (基因探 针印记杂交）验证电转成功。该基因将随PMV361整合于BCG染色体中，在BCG中获得稳定 的表达且长时间内不会随着重组后的BCG传代而丢失。将重组BCG即rBCG-Rv2645、BCG及 PBS(磷酸盐缓冲液空白对照组）分别免疫BALB/c小鼠，BCG作为阳性对照组、PBS作为阴 性空白对照组，继而进行结核杆菌标准菌株H37Rv (ATCC 25618)气溶胶攻毒感染。攻毒结 束后解剖小鼠取肺脏、脾脏做菌落计数、抗酸染色、及染色观察病理损伤程度。最终结果 显示，rBCG-Rv2645菌落计数低于BCG组，BCG又低于PBS空白对照组，且各差异具有统计学 意义。综合抗酸染色、染色的结果分析发现rBCG-Rv2645的免疫保护作用确实高于BCG 组，证实了 Rv2645蛋白在预防结核病方面具有较高的应用价值。
[0011] 一种结核分枝杆菌优势抗原蛋白，为RD13区Rv2645蛋白，该蛋白分子量大小约为 15. 6KD，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示；该蛋白的编码基因片段长432bp，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。经筛选实验证实Rv2645蛋白能显著刺激小鼠及人产生高水平的 结核特异性的细胞及体液免疫。目前为止，尚无其蛋白制备及功能的研究报道。
[0012] 作为结核分枝杆菌优势抗原的Rv2645蛋白的制备方法，包括如下步骤：
[0013] (1)以结核分枝杆菌的基因组为模板，使用下述引物扩增Rv2645基因；
[0014] 上游引物：5' -AITGGATCCATGACCACCACGC-3'，
[0015] 下游引物：5,-AATAAGCTTCCGCCGGTGTTCGC-3，；
[0016] (2)将Rv2645基因通过限制性内切酶BamH I和Hind III构建到原核表达载体 pET28a上得到重组质粒pET28a-Rv2645 ;
[0017] (3)再将pET28a-Rv2645转化到大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导和Ni-NTA亲和 纯化得到Rv2645蛋白。
[0018] 作为结核分枝杆菌优势抗原的Rv2645蛋白可用于结核病的诊断。
[0019] Rv2645蛋白能用于制备结核病T-SPOT的新型诊断试剂，可以用于区分结核感染 还是BCG接种。将按上述方法制备得到的Rv2645蛋白去内毒素且定量后可作为T-SPOT的 新型诊断试剂，用其刺激病人PBMC利用ELISP0T法检测INF-Y的释放水平。其较目前报 道的ESAT6-CFP10蛋白免疫原性强，刺激INF-Y水平更高。
[0020] Rv2645蛋白也能用于制备结核病特异IgG4抗体的新型诊断试剂，Rv2645用于检 测结核特异性抗体IgG4时其特异度及灵敏度高达80%以上。Rv2645为BCG缺失蛋白，当 其用于结核病人的血清学诊断时能用于区分结核感染还是BCG接种，包括如下步骤：
[0021] (1)将心2645蛋白定量后包被96孔板，1001^/1^，1001117孔。41：，包被过夜或 37 〇C>lh〇
[0022] (2) 2%的BSA封闭：包被板用PBS洗涤两遍后每孔加入2%的BSA，每孔200 ii L， 37°C，lh。封闭结束后PBS洗2遍，拍干，ELISA板4°C保存待用。
[0023] (3)样品孵育：血清样本用PBS进行200倍稀释后，每孔加入IOOii L，37°C，lh。结 束后用PBST洗板6遍，拍干。
[0024] (4)孵育抗体：加入带HRP标记的人IgG4抗体按说明书进行稀释。每孔100 ii L， 37°C，lh。结束后用PBST洗板6遍，拍干。
[0025] (5)加底物显色：将TMB底物IOOii L，37°C，l_5min ;等待变蓝。
[0026] (6)终止：显色稳定后加入终止液2M的H2SO4溶液50 ii L。
[0027] (7)检测：当终止变黄后，将ELISA板置于酶标仪读取OD值，检测波长为450nm。 结果进行统计分析，根据cut off值区分结核与非结核病人。
[0028] Rv2645蛋白作为结核分枝杆菌的优势抗原可用于结核病新型重组BCG疫苗或蛋 白疫苗。
[0029] -种结核病蛋白疫苗，为通过上述方法制备的Rv2645蛋白。
[0030] 一种结核病新型重组BCG疫苗，为能表达结核分枝杆菌优势抗原Rv2645蛋白的重 组BCG，其优选通过包含如下步骤的方法制备：
[0031] (1)以结核分枝杆菌的基因组为模板，使用下述引物扩增RV2645基因；
[0032] 上游引物：5, -AITGAAITCATGACCACCACGC-3'，
[0033] 下游引物：5'-AATAAGCTTCCGCCGGTGITCGC-3' ；
[0034] (2)将Rv2645基因通过限制性内切酶EcoR I和Hind III构建到穿梭质粒PMV361 中得到重组质粒pMV361-Rv2645 ;
[0035] (3)再将pMV361-Rv2645电转到BCG中得到能表达Rv2645蛋白的重组BCG，验证 成功后从而作为改良的新型重组BCG疫苗。
[0036] 本发明的优点和效果：
[0037] (I) Rv2645利用原核表达表达载体表达，Ni-NTA亲和层析进行纯化，方法简单，产 量高，且纯度较高。Rv2645蛋白较其他部分RD蛋白免疫原性强，刺激INF-Y水平最高。
[0038] (2)重组表达Rv2645蛋白的BCG疫苗在小鼠结核杆菌气溶胶攻毒实验中证实，其 比BCG的免疫保护作用增强，其抗结核保护作用得到了证实。
[0039] (3)将Rv2645整合于BCG上时，利用了较为先进的电转技术及穿梭质粒pMV361， 该质粒能将Rv2645基因整合于BCG染色体上，使其不同于普通质粒，不会在短期传代内丢 失。利于该基因在BCG中的长期稳定表达。
[0040] (4)同时大样本的病人血清及健康人血清相应抗体实验证实Rv2645在结核病血 清诊断上具有较高应用价值。特别是Rv2645用于检测特异性抗体IgG4时其特异度及灵敏 度高达80%以上，同时其与临床T-Spot诊断相符率达72%略高于T-Spot自身抗原蛋白成 分（CFP-10及ESAT-6)用于结核病人抗体IgG4诊断时的相符率（70% )。此外，Rv2645为 BCG缺失蛋白，当其用于结核病人的血清学诊断时能与接种过BCG的健康人区别开来。
【专利附图】
【附图说明】
[0041] 图1是灭活H37Rv预免疫小鼠的具体方案示意图。
[0042] 图2是RD10-14区蛋白刺激预免疫小鼠脾脏细胞及人PBMC后用ELISP0T及ELISA 法检测其产生的相应IFN- Y水平。A图为各RD纯化蛋白刺激灭活H37Rv预免疫小鼠的脾 脏细胞48h后用ELISP0T法检测其INF- Y释放水平，其中箭头所示处为释放水平前三位的 RD蛋白，分别为Rv2645、Rvl768及Rvl773。PHA(菜豆凝集素）为试剂盒所附淋巴细胞阳 性刺激物，Ag85B为已有报道的刺激INF-Y高水平释放的蛋白，在此作为本实验的自选阳 性对照；图中基因代号为简写。B图为A结果中部分斑点实图。C图为Rv2645、Rvl768及 Rvl773蛋白刺激结核病人及健康人PBMC后ELISA法检测其IFN- Y释放水平、ConA (刀豆 蛋白）为试剂盒附带的淋巴细胞阳性刺激物，其中Rv2645组具有差异统计学意义。
[0043] 图3是ELISA法检测Rv2645、Rvl768、Rvl773在24例TB病人及24例健康人中的 相应抗体总IgG及IgM水平。A图为IgG抗体的检测，其中Rv2645及Rvl768为p = 0? 0236 及p = 0. 0292,具有统计学差异p〈0. 05,而Rvl773的p = 0. 229。B图为IgM抗体的检测， 其中 Rv2645 及 Rvl768 为 p = 0. 0229 及 p = 0. 0394,具有统计学差异 p〈0. 05,而 Rvl773 的p = 0.4789。
[0044] 图4是Rv2645用于104例结核病人及104例健康人血清IgG、IgM、IgG2及IgG4 的检测。其中A为Rv2645的ELSIA检测的散点图，B为其相应的ROC曲线。Rv2645检测的 各抗体 P〈〇. 0001，其 ROC 曲线的 AUC 值分别为 0. 7865、0. 7760、0. 6781 及 0. 8205。
[0045] 图5是CE用于104例结核病人及104例健康人血清IgG、IgM、IgG2及IgG4的 检测。其中A为CE的ELSIA检测的散点图，B为其相应的ROC曲线。CE检测的p值分别 〈0? 0001、〈0? 001、>0? 05、〈0? 001。其 ROC 曲线的 AUC 值分别为 0? 6936、0. 6516、0. 5419 及 0.6475。
[0046] 图6是制备Rv2645的兔多克隆抗体用于2例非结核病人与2例结核病人肺组织切 片检测，并以CE作阳性对照（视野为100倍放大）。其中A-D为CE兔多克隆抗体与Rv2645 兔多克隆抗体用于1-2号非结核病人的肺脏组织切片检测作为阴性对照。E-F为CE兔多克 隆抗体与Rv2645兔多克隆抗体用于1-2号结核病人肺脏组织切片的检测。其中箭头所示 处为阳性棕区域结核结节（本应为棕黄色，非彩图中为深色区域）。
[0047] 图7是BCG电转插入pMV361_Rv2645重组穿梭质粒后卡那抗性板筛选板上的典型 单克隆菌落图。A为电转后rBCG-Rv2645的菌落形态图，B为rBCG-Rv2645电转后传代图形 态图，C为局部放大形态图。
[0048] 图8是rBCG-Rv2645的PCR及WB鉴定图。A为PCR验证图，其中1、3泳道分别为 阴阳对照，2为实验组，Rv2645的片段大小为432bp。B为Western-blot验证图，其中2, 3 泳道为阴阳性对照，1为实验组。结果显示，rBCG-Rv2645具有阳性条带。C-E为利用生物 素标记的Rv2645基因探针对提取的rBCG-Rv2645基因组进行Southern blot验证。
[0049] 图9是重组疫苗rBCG-Rv2645免疫小鼠攻毒后的肺脏（A)及脾脏（B)菌落计数。 结果显示，rBCG-Rv2645组与BCG及PBS具有统计学差异。
[0050] 图10是攻毒后的肺脏HE染色图。其中PBS组，肺泡结构不完整，箭头所示处结节 较大；BCG较PBS组大为改善，rBCG-Rv2645最完整，结节罕见。其中ABC图为40倍放大， DEF图为100倍放大的镜下图。
[0051] 图11是攻毒后的脾脏HE染色图。其中PBS组，箭头所示处淋巴结节边缘模糊炎 症较重，BCG较PBS组大为改善，rBCG-Rv2645组淋巴结节边缘整齐界限清楚。其中ABC图 为40倍放大，DEF图为100倍放大的镜下图。
【具体实施方式】
[0052] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指 明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0053] 实施例1RD10-14区各原核表达载体pET28a_RDs的构建
[0054] I. 1各RD基因引物的设计，构建所需具体引物见表1 :
[0055] 表1.各RD基因引物序列
【权利要求】
1. 结核分枝杆菌RV2645蛋白作为结核分枝杆菌优势抗原的应用，其特征在于：所述的 Rv2645蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 结核分枝杆菌Rv2645蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 以结核分枝杆菌的基因组为模板，使用下述引物扩增Rv2645基因； 上游引物：5' -ATTGGATCCATGACCACCACGC-3'， 下游引物：5'-AATAAGCTTCCGCCGGTGTTCGC-3' ； (2) 将Rv2645基因通过限制性内切酶沒I和"i/?d III构建到原核表达载体pET28a 上得到重组质粒pET28a-Rv2645 ; (3) 再将pET28a-Rv2645转化到大肠杆菌BL21中，通过IPTG诱导和Ni-NTA亲和纯化 得到Rv2645蛋白。
3. 结核分枝杆菌Rv2645蛋白在制备结核病T-SP0T的新型诊断试剂中的应用。
4. 一种结核病T-SP0T的新型诊断试剂，其特征在于：将按权利要求2所述的方法制备 的Rv2645蛋白去内毒素得到。
5. 结核分枝杆菌Rv2645蛋白在制备结核病特异IgG4抗体的新型诊断试剂中的应用。 6. Rv2645蛋白作为结核分枝杆菌的优势抗原在结核病新型重组BCG疫苗或蛋白疫苗 中的应用。
7. -种结核病蛋白疫苗，其特征在于：为按权利要求2所述的方法制备的Rv2645蛋 白。
8. -种结核病新型重组BCG疫苗，其特征在于：为能表达结核分枝杆菌Rv2645蛋白的 重组BCG。
9. 根据权利要求8所述的结核病新型重组BCG疫苗，其特征在于通过包含如下步骤的 方法制备得到： (1) 以结核分枝杆菌的基因组为模板，使用下述引物扩增Rv2645基因； 上游引物：5' -ATTGAATTCATGACCACCACGC-3'， 下游引物：5'-AATAAGCTTCCGCCGGTGTTCGC-3' ； (2) 将Rv2645基因通过限制性内切酶feoR I和班/?d III构建到穿梭质粒pMV361中得 到重组质粒pMV361-Rv2645 ; (3) 再将pMV361-Rv2645电转到BCG中得到能表达Rv2645蛋白的重组BCG。
【文档编号】C12N15/31GK104292315SQ201410582674
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】章晓联, 罗微, 屈子璐 申请人:武汉大学