肿瘤细胞特异性多克隆t细胞制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学和细胞免疫学技术领域，特别是涉及肿瘤细胞特异性多克 隆T细胞制备方法，通过该方法制备的肿瘤细胞特异性多克隆T细胞在预防或治疗癌症的 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 目前，过继性免疫细胞治疗在治疗黑色素瘤和血液系统的肿瘤中取得了突破性进 展；因此，再次成为肿瘤免疫治疗研究领域的热点。国际上，选择的效应细胞主要包括肿瘤 浸润淋己细胞（tumor infiltrating lympho巧te, TIL)、肿瘤抗原或病毒抗原特异性细 胞毒性T细胞（巧totoxic T lympho巧te, CTL)和嵌合抗原受体修饰的T细胞（chimeric antigen receptor modified T lympho巧te, CART);国内，临床应用的还主要是20世纪80 年代发明的细胞因子诱导的杀伤细胞（巧tokine in化ced killer cell, CIK)及在此基础 上改进的树突状细胞活化的细胞因子诱导的杀伤细胞（DC-CIK)。CIK及DC-CIK细胞制备工 艺相对简单、很容易在临床进行规模化推广，但由于其主要通过非特异性机制杀伤肿瘤细 胞，目前的临床结果显示，疗效非常有限。TIUCTL和CART在临床上取得了很好的临床治疗 效果，但是TIL却存在取材困难，而且需要经过1~2个月较长时间的培养，因此，很难在临床 规模化推广应用；CTL细胞的制备，首先分离出肿瘤或者病毒特异性抗原，然后分离单核细 胞诱导DC，在此过程中加入特异性抗原，使成熟的DC最后能够通过主要组织相容性复合体 (major histocompatibility complex, MHC)编码的 I、II 类分子的形式递呈到 DC 表面， 然后与T细胞共培养诱导CTL细胞的产生，整个过程中涉及到抗原制备、DC和T细胞分离 培养，因此工艺较为复杂；CART的制备目前主要方式是通过慢病毒载体进行基因修饰，工 艺流程更为复杂，而且成本高昂，因此，目前还处于临床试验阶段，很难在临床规模化应用。 最近研究显示，慢性淋己细胞白血病（C虹onic lympho巧tic leukemia,化L)患者来源的 外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)，在体外培养中加入一种 双碑1 向特异性抗体（Bispecific Antibody, BsAb)的药物 blinatumomab (CD3XCD19),同 时加入IL-2,能够消除PBMC中的白血病细胞，同时诱导的多克隆T细胞能够显示出较强的 杀瘤效应（Golay等，2014)。但该技术使用的双祀向特异性抗体涉及到在体外进行生产、纯 化、包装、运输、保存等环节，因此成本高昂、并且费时费力；此外，该技术制备的多克隆T细 胞仅针对B细胞系肿瘤，应用范围非常有限。因此，如何克服上述系列技术的限制性，开发 出一种能够针对大部分肿瘤甚至全部肿瘤类型的、工艺简单、成本低廉的肿瘤特异性T细 胞制备通用技术，则是目前肿瘤免疫治疗面临的关键问题和难题。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了 一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞（tumor specific polyclonal T lymphocyte, TSPT)的制备方法及其在预防或治疗癌症的药物中 的应用。
[0004] 第一方面，本发明提供了 TSPT细胞的制备方法，所述TSPT细胞是通过获取PBMC 然后用基因修饰肿瘤细胞与获取的PBMC共培养制备所得。尽管获取PBMC和体外制备特异 性T细胞的方法已经很多，但目前还没有描述通过对肿瘤细胞进行双重基因修饰，修饰的 肿瘤细胞能同时表达分泌型基因工程抗体（Genetic engineering Antibody, GeAb)和膜 结合型祀抗原（Target Antigen, TAg)，然后用上述基因修饰肿瘤细胞与PBMC共培养获取 TSPT细胞的组合型方法。上述组合中，制备TSPT细胞的原理是：基因修饰肿瘤细胞能够分 泌GeAb同时又能表达膜结合型TAg，在与PBMC混合培养的过程中，GeAb通过识别TAg和T 细胞，将二者较链在一起，从而有利于基因修饰肿瘤细胞对T细胞的抗原递呈，然后进一步 刺激、活化和扩增T细胞形成TSPT细胞，培养过程中基因修饰肿瘤细胞被杀死；对肿瘤抗原 明确的肿瘤细胞来说，进行基因修饰表达TAg,起到了强化抗原抗体特异性识别的作用，而 对肿瘤抗原不明确的肿瘤细胞来说，通过选择一个已知的TAg进行修饰，则起到了架起抗 原抗体特异性识别的作用。因此该技术方案，解决了目前大部分肿瘤抗原不明确或者表达 量低的肿瘤细胞无法与T细胞识别进而诱导特异性T细胞产生的技术难题。该方法包括如 下步骤；首先采集外周静脉血，然后用聚藏糖-泛影葡糖胺密度梯度离也法分离获取PBMC， 将上述PBMC与基因修饰肿瘤细胞进行混合，然后在含有重组人白介素-2 (Recombinant Human Interleukin-2, rh]X-2)的培养基中共培养。随后每2~3天，对细胞进行计数，然 后用含有rhIL-2的新鲜培养基调整细胞到适宜密度后继续培养，培养9~20天后，所收集的 细胞即为TSPT细胞。
[0005] 优选地，初始培养PBMC和基因修饰肿瘤细胞的密度分别均为（0. 5 ~2) X l〇6/ml， 两者混合的体积比为0. 1~10。
[0006] 进一步优选地，初始培养PBMC和基因修饰肿瘤细胞的密度分别均为1 X l〇6/ml，两 者混合的体积比为1。
[0007] 优选地，使用rh比-2的终浓度为50 ~ 1000 lU/ml。
[0008] 进一步优选地，使用rh比-2的终浓度为300 lU/ml。
[0009] 优选地，随后每2~3天，细胞培养的适宜密度为（0.5 ~ 3) Xl〇6/ml。
[0010] 进一步优选地，随后每2~3天，细胞培养的适宜密度为IX l〇6/ml。
[0011] 第二方面，本发明提供了一种基因修饰肿瘤细胞的制备方法，所述基因修饰肿瘤 细胞可W通过同时具有编码GeAb和TAg (GeAb. TAg)基因的载体转染肿瘤细胞获得。
[001引优选地，所述GeAb基因具有编码GeAb的碱基序列，所述GeAb为BsAb，所述BsAb 具有祀向T细胞抗原表位的结合位点和肿瘤细胞表面抗原表位结合位点的分泌型BsAb。
[0013] 优选地，所述TAg基因是具有编码TAg的碱基序列，所述TAg选之组织特异性分化 抗原、致癌病毒表达的肿瘤抗原、突变基因或癌基因的表达产物、异常表达的细胞蛋白和胚 胎抗原中的一种。
[0014] 优选地，所述载体选之慢病毒表达载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病 毒载体、非复制型病毒载体、复制型病毒载体和睡美人转座子等中的一种。
[0015] 优选地，所述肿瘤细胞选之肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、肠癌、宫颈癌、乳腺癌和鼻咽 癌等肿瘤细胞中的一种。
[0016] 第H方面，本发明提供了一种编码GeAb. TAg基因载体的构建方法，所述具有编码 GeAb. TAg基因的载体是在载体的多克隆位点（MCS)中插入GeAb. TAg基因序列组合而成，所 述GeAb.TAg基因序列包括依次连接的编码免疫球蛋白K链信号肤的碱基序列、编码Flag 标签的碱基序列、GeAb的碱基序列、编码组氨酸化s6标签的碱基序列、P2A的碱基序列、TAg 基因和终止密码子。
[0017] 优选地，所述载体选之慢病毒表达载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病 毒载体、非复制型病毒载体、复制型病毒载体和睡美人转座子等中的一种。
[0018] 进一步优选地，所述载体为慢病毒表达载体。
[0019] 优选地，所述免疫球蛋白K链信号肤的碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0020] 优选地，所述Flag标签的碱基序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0021] 优选地，所述GeAb基因为BsAb基因。
[0022] 进一步优选地，所述BsAb的基因由编码抗CD20抗体的单链抗体（single-chain antibody fragment, scFv)基因和编码抗CD3的scFv基因通过短链（GGGGS)链接而成 (CD20XCD3)。
[0023] 进一步优选地，所述BsAb的碱基