一种牛脐带间充质干细胞的分离及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生命科学领域，具体设及一种牛厮带间充质干细胞的分离及培养方 法。
【背景技术】
[000引 间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSC)是干细胞家族的重要成员，来源 于发育早期的中胚层和外胚层。MSC具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能 力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导分化为神经、屯、脏、肝脏、骨、软骨、肌腫、脂肪、上 皮等多种组织细胞。
[0003] MSC由于具有自我更新和多向分化的潜能，成为了近年来研究的热点。大量研究证 实，MSC可W从骨髓分离得到，但也存在于其他不同组织和脏器，如肌肉、脂肪组织、厮血、厮 带、胎盘、血管等。
[0004] 厮带是哺乳类具有的连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉、一条静脉W及包 裹于它们表面的胶冻状组织-华通氏胶（Wharton' S jelly)所组成。2003年Romanov等 从厮静脉内皮、厮带华通氏胶和血管周围组织中分离获得了 MSCs。厮带来源的MSC经过 原代培养后形成的成纤维细胞，它们的形态、表面标记及其分化潜能与骨髓间充质干细胞 炬M-MSC)相似。
[0005] 来源于厮带的MSC，由于属于胚胎外组织，是胎儿分娩后的废弃物，来源广泛、获得 成功率高、含量高、增殖能力强、免疫原性低、生物性能稳定、无社会伦理道德限制等优点。
[0006] 目前针对牛厮带MSC的分离方法尚未建立，现有技术中对于人厮带MSC研究得较 多，主要的分离方法是酶消化法跟组织块贴壁法。酶消化法分离厮带间充质干细胞的方法 存在一些缺点，酶消化的过程需要消耗一定的时间，延长了分离的时间；而且使用膜酶或胶 原酶消化厮带，也大大增加了分离过程的成本；再次，酶消化法过程较为繁琐，且在分离的 效果上稳定性较差。组织块贴壁法虽然在获得原代细胞的时间上比较长，但是其操作上比 较简单，成本也比较低，因此更加适合推广与应用。另外，分离所得到的原代细胞一般数量 较少，需在体外进行传代扩增，现有技术中常见的培养体系就是采用DMEM/F12培养基加上 体积比为10 %的胎牛血清（FB巧进行厮带MSC的体外培养与扩增。
【发明内容】
[0007] 本发明技术W牛厮带为组织材料，采用了操作较为简便的组织块贴壁法对牛厮带 进行了 MSC的原代分离，并对其进行了扩增培养，成功分离得到了牛厮带MSC。扩增培养体 系在无血清培养基（厂家；Lonza，商品名：通用Ultra CULTURE无血清培养基），并添加了 表皮细胞生长因子巧GF，浓度范围5~lOng/mL) W及血小板衍生因子（PDGF，浓度范围5~ lOng/mL)，促进了牛厮带MSC的高效扩增。
[000引现有技术中酶消化法分离厮带MSC的方法存在一些缺点，酶消化过程延长了分离 的时间；而且使用膜酶或胶原酶消化厮带，也大大增加了分离过程的成本；再次，酶消化法 过程较为繁琐，且在分离的效果上稳定性较差。另外采用DMEM/F12培养基加上体积比为 10%的胎牛血清（FB巧的培养体系，细胞生长必须依赖于胎牛血清，培养的细胞分化或衰 老得较快。
[0009] 本发明目的通过W下技术方案来实现。
[0010] 一种牛厮带间充质干细胞的分离及培养方法，包括W下步骤：
[0011] (1)获取胎牛厮带，获得牛厮带组织块，剪碎，将完全培养基加到组织块中，吹打均 匀后转移到细胞培养皿中；
[0012] (2)摇晃培养皿使组织块均匀分布于培养皿中，转移至细胞培养箱中培养，并定期 添加完全培养基；
[0013] (3)当细胞爬出后，弃掉旧培养基及组织块，用PBS清洗培养皿后，加入完全培养 基继续置于细胞培养箱中培养；
[0014] (4)当细胞融合度达到80%~90%后，弃去旧培养基，用PBS清洗培养皿后，加入 含邸TA的膜酶混合液进行1~3min，待80%~90%细胞变圆即加入完全培养基终止消 化，，并将细胞吹打成单细胞悬液，获得牛厮带间充质干细胞；
[0015] 所述完全培养基为添加了 EGF和PDGF的无血清培养基，其中EGF的浓度为5~ lOng/mL，PDGF 的浓度为 5 ~lOng/mL。
[0016] 优选，步骤（1)所述完全培养基的加入量是每1cm厮带添加1ml完全培养基。
[0017] 所述定期添加完全培养基是每隔3-5天添加一次，每次完全培养基的添加量为 3ml。
[0018] 优选，所述获取胎牛厮带的步骤包括：
[0019] (1)取4月龄带子宫的胎牛，低温运输箱中保存，3小时内送至实验室；
[0020] (2)在超净台中从子宫中取出胎牛，用剪刀剪断厮带，放入装有预冷的75 %己醇 的玻璃平皿中浸泡10s ;
[0021] (3)将厮带转移到另一个装有预冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血错夹住厮带 一端，用平綴挤掉血管中的血液，并清洗厮带表面血溃；重复清洗一次获得胎牛厮带。
[0022] 优选，所述获得牛厮带组织是将胎牛厮带剪成1cm的小段，用组织綴剥掉厮带外 面的膜，再去除动脉和静脉，把获得的组织剪至1mm 3大小。
[0023] 所述细胞培养箱的培养条件是5 % CA、37 °C、饱和湿度为95%。
[0024] 优选，所述无血清培养基为Lonza公司的通用Ultra CULTURE无血清培养基。
[0025] 步骤（4)所述膜酶混合液中邸TA的浓度为0.0 lg/l，膜酶的浓度为0. 25g/l，浓度 均为质量体积比。
[0026] 现有技术存在缺点的导致原因：
[0027] 1、酶消化是一个较缓慢的过程，在操作上也比较繁琐，消化后还需要经过离屯、收 集与洗漆去掉膜酶或胶原酶，所W处理起来所需的时间比较长。
[002引 2、膜酶或胶原酶是比较贵的生物制剂，所W采用酶消化法相对组织块贴壁法，成 本会大大提局。
[0029] 3、经过酶消化后的细胞贴壁性较差，导致了分离效果的不稳定。
[0030] 4、原有的培养体系中，细胞的生长必须依赖于胎牛血清，而且没有添加EGF及 PDGF成分，EGF及PDGF可W促进该细胞的增殖，抑制该细胞的分化。
[0031] 本发明相对于现有技术所具有的优点及有益效果：
[003引 （1)现有技术中一般采用酶消化法进行厮带MSC的原代分离，而培养体系是一般 都采用0161/。12培养基加上体积比为10%的胎牛血清（。8巧进行15(：的体外培养，本发明 采用了组织块贴壁法，操作简便，成本也较低，而且得到的MSC纯度比较高。
[0033] (2)本发明采用组织块贴壁法对牛厮带MSC进行了原代分离，在无血清培养基中 加入了 EGF及PDGF进行培养扩增，成功得到了具有自我更新及分化潜能的牛厮带MSC。在 培养体系中添加了 EGF及PDGF，不仅促进了该细胞的体外扩增，并抑制了该细胞在体外培 养的分化。
[0034] 做在组织块爬出细胞阶段，采用逐步添加培养基的方法，相对于一次性加入大量 的培养基的方法，该方法可提高组织块贴壁率，进而加快细胞爬出的速度。
【附图说明】
[0035] 图1为厮带MSC细胞的生长曲线图；
[0036] 图2为牛厮带MSC原代细胞形态图；
[0037] 图3为牛厮带MSC P3代细胞形态图；
[0038] 图4为牛厮带MSC P3代细胞流式鉴定图；
[0039] 图5为对比例细胞形态的对比图。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1牛厮带MSC的分离及培养
[0041] 1、采集胎牛厮带
[0042] (1)取4月龄带子宫的胎牛，低温运输箱中保存，3小时内送至实验室。
[0043] (2)在超净台中从子宫中取出胎牛，用剪刀剪断厮带，放入装有预冷的75 %己醇 的玻璃平皿中浸泡10s。
[0044] (3)将厮带转移到另一个装有预冷的PBS溶液的玻璃平皿中，用止血错夹住厮带 一端，用平綴挤掉血管中的血液，并清洗厮带表面血溃。重复清洗一次。
[0045]