一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞注射液及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD)是由于冠状动脉循环改变引起冠 状动脉血流与心肌细胞需求之间不平衡而导致的心肌损害。尽管近年来，经皮冠状动脉介 入治疗（PCI)、冠状动脉搭桥术（CABG)及药物治疗取得了长足的发展，但缺血性心脏病仍 然是世界范围内的头号死因，有20 %的病例因冠脉病变严重或弥漫，常规药物治疗效果不 佳且无法手术治疗，IHD病患也被称为"无选择权（No-option)"患者。慢性缺血性心脏病 的临床处置方式有限，疗效和预后较差，需要寻找更加有效的新型治疗方式。最近，实验和 临床研宄表明，干细胞治疗IHD潜力巨大，但是大多数研宄多集中在急性缺血领域，而慢性 缺血性心脏病研宄较少。
[0003] 近年来，干细胞研宄的进展为多种慢性和顽固性疾病的治疗提供了新的策略。鉴 于安全性考虑，目前间充质干细胞在临床前和临床研宄中安全性记录良好，已经有部分疾 病如移植物抗宿主病（GvHD)将间充质干细胞（MSC)引入临床治疗。MSC可来源于多种组 织，目前常用的MSC为骨髓来源。已经有研宄表明，骨髓来源的MSC(BM-MSCs)可以用于心 脏损伤的修复，临床研宄的结果也显示出巨大的前景。多个临床前研宄表明，BM-MSCs治疗 后可提高心功能和减少梗死面积。然而，也有研宄发现，高龄和疾病会影响干细胞的数量和 质量，治疗老年人的干细胞用于治疗损伤的心脏效果比治疗年轻人的干细胞差。此外，抽取 骨髓的具有创伤性、病毒污染的风险和有限的骨髓供者都限制了 BM-MSCs的应用。目前已 经有研宄采用其他来源如脂肪组织，脐带组织来源间充质干细胞，也取得了良好的效果。脐 带华通氏组织具有丰富的MSCs，且具有取材无损伤、细胞产量高、增殖能力强等特点。有研 宄表明，脐带华通氏胶来源MSC (WJ-MSCs)具有分化为多种细胞的潜能，包括心肌细胞。
[0004] 目前脐带间充质干细胞制备主要通过新生儿脐带经过消化进行制备，但大规模的 需求量需要更高效率的制备方法，目前针对心脏类疾病研宄与使用中的脐带间充质干细胞 的公开技术有：CN 101690731 B脐带华通胶源间充质干细胞在制备因冠心病及扩张性心 肌病引起的心力衰竭细胞移植材料中的应用，该发明提供了将新鲜制备或经液氮冻存处理 后的间充质干细胞经复苏后再次培养，再与氯化钠注射液等混合进行输注或注射的方法； 但此方法在8-24小时后细胞活性即大幅下降，无法长期保证细胞活性；另外还需要进行 治疗的机构设立有无菌的细胞培养中心与专业的细胞培养制备人员，每一次治疗均要单独 培养，不同操作人员的操作差异带来的细胞质量不统一，并且增大了染菌污染的风险。CN 102908364A公开了一种间充质干细胞注射液及其制备方法和在制备治疗儿童扩张型心肌 病药物中的应用，，间充质干细胞注射液含有：2X IO5-I X IO7个/mL的间充质干细胞，体积 比为5-8%的临床级DMS0,1-6%的人血白蛋白和复方电解质溶液。
[0005] 细胞治疗途径与治疗效果密切相关。目前用于干细胞治疗最常采用的移植方式 有三种，分别是心肌内、冠脉和静脉注射。每种移植方式都有利有弊，心肌内注射能够将细 胞直接注射至损伤的心肌，可提高细胞局部植入率，但是它要求复杂的设备和高超的手术 技巧。冠脉内注射创伤小，并且被广泛应用于临床，操作方便，但有报道认为细胞滞留率下 降。心肌内注射与冠脉内注射的优劣目前仍然有争议。静脉注射在干细胞治疗的临床研宄 中被广泛采用，而且简单安全，但在心脏疾病治疗方面，有研宄认为静脉注射后大多滞留在 肺部，所以很难归巢到心脏，不能起到治疗效果。但是，有研宄发现，静脉移植细胞也能够提 高心功能并且减少梗死面积，并认为这可能与细胞滞留在肺组织后分泌的TSG6有关。TSG6 能促进心脏损伤的修复，但单一给药方式无法满足复杂的缺血性心脏病病情，因此为了进 一步提高治疗效果，采取新的多种方式联合给药亟待突破。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一在于提供一种冻存后复苏效果极佳的脐带间充质干细胞注射 液及其制备方法和应用；
[0007] 本发明的目的之二在于提供一种能用于制备治疗慢性缺血性心脏病药物的脐带 间充质干细胞注射液及其制备方法和应用。
[0008] 第一方面，本发明提供一种脐带间充质干细胞注射液，脐带间充质干细胞和混合 溶液，所述混合溶液包括：电解质平衡液、羟乙基淀粉、三磷酸腺苷二钠-氯化镁、二甲基亚 砜和人血白蛋白。
[0009] 其中，电解质平衡液与人血白蛋白分别维持晶体渗透压及胶体渗透压，使细胞处 于良好的渗透压环境，利于生长；二甲基亚砜（DMSO)为常规临床使用细胞冻存保护剂；羟 乙基淀粉可使得细胞膜表面负电荷化，防止细胞聚集，也可使聚集细胞解聚，从而使细胞呈 单个分离状态，有利于提高复苏后细胞存活率，保障输注时不堵塞器具；三磷酸腺苷-二钠 氯化镁可直接向间充质干细胞提供能量，提高复苏后存活率与细胞状态。所述组分的混合 可以提高冻存细胞的活率与输注后的效果，形成冻存-输注一体化溶液，可以经过解冻复 苏后直接注射且效果极佳，免去了等待的时间和处理的工序。
[0010] 优选地，所述电解质平衡液为勃脉力A、醋酸钠林格注射液、乳酸钠林格注射液或 转化糖电解质注射液中的任意一种或至少两种的混合溶液，例如可以是勃脉力A，醋酸钠 林格注射液，乳酸钠林格注射液和转化糖电解质注射液的混合溶液，醋酸钠林格注射液、乳 酸钠林格注射液和转化糖电解质注射液的混合溶液，或勃脉力A、醋酸钠林格注射液、乳酸 钠林格注射液和转化糖电解质注射液的混合溶液；电解质平衡液是根据不同病患身体情 况及对所含物质的用药禁忌进行选择的。其中，每1000 mL勃脉力A注射液中含有有氯化 钠5. 26g、葡萄糖酸钠5. 02g、醋酸钠3. 68g，氯化钾0. 37g和氯化镁0. 30g ;每1000 mL醋酸 钠林格注射液中含有氯化钠6. 0g、醋酸钠3. 8g、氯化钾0. 30g和氯化钙0. 20g ;每1000 mL 乳酸钠林格注射液中含有乳酸钠3. 10g、氯化钠6. 00g、氯化钾0. 30g和氯化钙0. 20g ;每 1000 mL转化糖电解质注射液中含有葡萄糖50g，果糖50g，氯化钠 I. 46g，氯化钾I. 86g，氯化 镁0· 286g，磷酸二氢钠0· 75g和乳酸钠2. 80g。
[0011] 优选地，所述羟乙基淀粉为羟乙基淀粉130/0. 4,其化学名称为聚（氧-2-羟乙 基）淀粉130/0. 4,为临床应用血液容量扩充剂，具有较好的细胞保护作用。
[0012] 优选地，所述三磷酸腺苷二钠-氯化镁（化学名称腺嘌呤核苷-5' -三磷酸酯二 钠盐）为冻干粉剂，即无菌冻干品，每瓶含有三磷酸腺苷二钠 IOOmg和氯化镁32mg ;三磷 酸腺苷二钠-氯化镁不仅对冻存复苏后的细胞可以直接提供能量，增加细胞复苏后的活 率，维持细胞的正常代谢能力；针对病灶原位注射或静脉输注后，还能支持间充质干细胞在 病灶损伤处聚集时的初始能量，增加在病患处间充质干细胞聚集量，加快病灶的修复速度； 此外，间充质干细胞在病患处进行修复时利用旁分泌作用亦可带动自身干细胞进行修复， 此过程中同时需要能量供给，而三磷酸腺苷二钠-氯化镁可在多次输注过程中起到如上作 用。优选地，所述二甲基亚砜为临床级。
[0013] 所述人血白蛋白为药典规定的人血白蛋白制品；优选地，本发明限定的人血白 蛋白的浓度为 10-25%，例如可以是 10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、 19%、20%、21%、22%、23%、24% 或 25%，优选为 20%。
[0014] 优选地，所述脐带间充质干细胞的浓度为5X 105-1 X 106个/mL，例如可以是 5Xl〇t/mL、5.5Xl〇t/mL、6Xl〇t/mL、6.5Xl〇t/mL、7Xl〇t/mL、7.5Xl〇t /mL、8X IO5个 /mL、8. 5X 10 5个 /mL、9X 10 5个 /mL、9. 5X 10 5个 /mL 或 IX 10 6个 /mL。
[0015] 优选地，所述混合溶液包括以下组分：
[0016] 体积百分含量为25-70 %的电解质平衡液；
[0017] 体积百分含量为5-20%的二甲基亚砜；
[0018] 体积百分含量为1-50%的人血白蛋白；
[0019] 按g/mL计的质量体积百分比为1-10%的轻乙基淀粉；和
[0020] 按g/mL计的质量体积百分比为5-20%的三磷酸腺苷二钠-氯化镁。
[0021] 其中，电解质平衡液的体积分数可以是25 %、30 %、35 %、40 %、45 %、50 %、55 %、 60%、65%或70%;二甲基亚砜的体积分数可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、 13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20% ;人血白蛋白的体积分数可以是1 %、5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%;羟乙基淀粉的质量体积百分比可以 是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%;三磷酸腺苷二钠-氯化镁的质量体积 百分比可以是 5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、 19%或 20%。
[0022] 优选地，所述混合溶液包括以下组分：
[0023] 体积百分含量为30-60 %的电解质平衡液；
[0024] 体积百分含量为10-20%的二甲基亚砜；
[0025] 体积百分含量为10-40%的人血白蛋白；
[0026] 按g/mL计的质量体积百分比为5-10%的轻乙基淀粉；和
[0027] 按g/mL计的质量体积百分比为10-20%