专利名称：人脐带间充质干细胞及其制备方法
技术领域：
本发明涉及原始间充质干细胞的制备方法，尤其涉及以人脐带沃顿胶为材料制备 人脐带间充质干细胞及其制备方法。
背景技术：
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一类具有多向分化潜能的组织 干细胞，可从胎儿血液、肝脏、骨髓、脂肪等多种组织获得。骨髓源性MSC存在高度病毒污染 的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势。其他方法如从 脐血和外周血中培养MSC具有一定难度，且MSC在足月分娩的脐血或动员的外周血中数量 尚存在争议。进来有学者从娩后的废弃材料脐带中分离培养MSC，并进行形态学、分化功能 和表面标志物等生物学表型鉴定。脐带是连于胚胎脐部与胎盘问的索状结构，外被羊膜、 内含分化的粘液性结缔组织，结缔组织内除闭锁的卵黄囊和尿囊外，还有脐动脉和脐静脉。 脐带中的MSC来源分为四种①来源于沃顿胶(Wharton’ s jelly, WJ)，它是包裹血管周 围的粘蛋白样组织，距血管外周大约3mm，富含透明质酸和葡萄糖胺聚糖，形成了成纤维细 胞周围的水凝胶结构；②来源于脐血管周围；③来源于脐血；④来源于脐静脉血管内皮下。 McElreavey等从人脐带的WJ组织中发现一种具有高分化潜能的成纤维样细胞。Sarugaser 等发现WJ区域富含祖细胞，这个区域的细胞被称为人脐带血管外周细胞(human umbilical cord perivascular cell，HUCPV)。HUCPV细胞具有较高的成纤维样细胞集落形成能力， 且骨诱导后可增殖分化形成骨结节。Romanov等采用培养骨髓MSCs的方法进行培养，从人 脐静脉内皮和内皮下层分离到类似骨MSCs的细胞。上述研究显示，脐带组织含有丰富的 MSCs，能够成为MSCs的良好来源。目前分离和培养人脐带MSC的方法不尽相同，分离效果也大相径庭。分离方法大 体上包括胶原酶消化法、植块法或两者的结合、脐静脉内膜消化法，其中胶原酶消化法多以 胶原酶II为主。人脐带MSC在适当的诱导条件下能向多种组织细胞分化，是理想的组织工程种子 细胞。MSC诱导植入有望成为较广泛的细胞治疗于段。研究表明MSC能够植入肌肉退化组 织并向肌细胞分化，也能够促进造血干细胞的植入；MSC还可应用于软骨组织重建等生物 工程；也可能成为未来抗癌治疗中携带自杀基因或抗癌腺病毒药物的载体细胞。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种材料来源易得，细胞倍增时间短的人脐带 间充质干细胞及其制备方法，按本发明方法制备的间充质干细胞具有更强的自我更新及多 向分化潜能，而且易于冷冻保存。实现本发明目的的技术方案，采用胎儿脐带为原材料制备间充质干细胞。制备方 法为脐带从保存液取出后，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含抗生 素的Hanks，Balanced Salt Solution(HBSS) (IX)中，用D-PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血管，暴露沃顿胶，然后将脐带剪成l_3mm3大小的组织块后放入试剂瓶，加入 0. 的消化液，置于37°C恒温震荡仪内持续消化4-10h，100目筛网过滤，离心收集细胞。 加入HBSS液冲洗细胞3次，用DMEM/F12培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度4. 8 X IO3 1 X 104/cm2，接种于6孔板内，37°C、体积分数为5% CO2孵箱内培养，24h后换液，以后每隔3 天换液一次，待细胞达到80%融合时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。作为优化，制备的间充质干细胞为脐带沃顿胶、脐带血管周围、脐血和脐静脉血管 内皮下的任何一种来源或全部。用于清洗脐带及其血管残留血液的溶液是不含钙镁离子的D-PBS溶液；冲洗沃顿 胶组织块所用液体优选无血清DMEM/F12培养基溶液。作为优化，脐带是经过D PBS清洗血管后剪成l_3mm3的组织块，进入下一分离程序。用于原始间充质干细胞的制备方法，可用II型胶原酶消化法、IV型胶原酶消化 法、II型胶原酶和胰酶联合消化法或II型胶原酶和透明质酸酶混合液消化脐带组织，作为 优化，首选II型胶原酶和透明质酸酶混合液进行消化。作为优化，用于消化脐带组织块的消化液为II型胶原酶和透明质酸酶的混合溶 液，其质量体积百分比浓度为0. 1%。作为优化，接种细胞使用的培养液为含有体积分数为10-20%的FBS和25mmol/L 谷氨酰胺的DMEM/F12。对于按照本发明上述方法制备的间充质干细胞，按照“国际细胞疗法协会”(ISCT) 制定的标准进行生物学表型鉴定，表现出以下技术特征1)在最佳培养体系条件下细胞贴壁生长，可形成CFU-F集落，形态相对均一，呈平 行排列生长或旋涡状生长的梭形细胞；2)表达粘附分子受体标记物⑶29、⑶44，间质细胞标记⑶73、⑶105，干细胞标记 物⑶90 ；而不表达内皮细胞标记物⑶31和造血干细胞标志⑶34，也不表达HLA-DR ；3)体外可诱导分化为成骨细胞及心肌样细胞。上述鉴定结果表明被发明制备的间充质干细胞非造血干细胞，并且具有上述技术 特征，符合间充质干细胞产品合格标准。按本发明方法制备的间充质干细胞在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍， 可得到大量富有活性的间充质干细胞，并能够长时间保存而不失其活性，且操作简单易行， 并且经过流式细胞仪检测、细胞周期检测以及体外分化实验鉴定，获得的间充质干细胞纯 度和细胞活性较高，具有良好增殖潜力，可快速建立细胞库，成本低廉，可直接用于科学实 验研究和临床上的辅助治疗，富有应用前景。
图1是原代细胞贴壁后至80%融合的细胞形态图，其中，A为第1天细胞形态；B 为第3天细胞形态；C为第7天细胞形态。图2是第4代间充质干细胞流式细胞仪检测的免疫表型细胞含量图。图3A 是第4代间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞和心肌样细胞形态 图一骨涎蛋白免疫组化染色。
图3B是是第4代间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞和心肌样细胞形态 图一RT-PCR检测心肌特异性基因的表达电泳图，泳道1，2-α-横纹肌肌动蛋白；泳道3， 4-心肌肌浆网钙ATP酶；5，6-人心肌转录因子GATA4 ；泳道7，8- α -肌球蛋白重链；泳道9， 10人心肌转录因子ΝΚΧ2. 5 ；泳道11，12-肌钙蛋白I ；泳道13，14-内参GADPH0
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不受限于下述 实施例。实施例1 人脐带胎盘间充质干细胞的制备经产妇知情同意，采集足月剂宫产健康胎儿脐带或胎盘。脐带或胎盘采集之前产 妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转 氨酶、支原体等检测，全部合格以确保安全性后方可采集。1、脐带或胎盘自手术台取下后，浸入含抗生素的0.9%生理盐水中，4°C保存；2、在操净台内取出脐带或胎盘，用D-PBS冲洗净表面残余血液；3、将脐带或胎盘剪成l_3mm3大小的组织块后放入200mL蓝盖试剂瓶，加入质量体 积百分比浓度0. 的消化液，置于37°C恒温振荡仪内持续消化4 IOh ；4、100目筛网过滤收集细胞；5、加入D-Hank’ s液冲洗细胞3次，用含体积分数为10_20 %胎牛血清和谷氨酰 胺的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4. 8 X IO3 1 X IO4) /cm2,接种于6孔板内，于 37°C、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24-72h后换液，图1。实施例2 人脐带胎盘间充质干细胞的细胞特征1、免疫表型检测 CD29，CD44,，CD73, CD90, CD105, CD31, CD34, HLA-DR(见表 1)。 将第4-7代人脐带胎盘来源的间充质干细胞接种于滚瓶中，待细胞达到80-90%融合时 使用IOml胰酶消化，将细胞悬液转入50ml离心管中并以IOOOrpm离心3分钟。离心之 后，弃掉上清，PBS洗涤2次，分成每管1 X IO6细胞，第一管为空白对照(只含间充质干细 胞)，用于调节流式细胞仪的电压，第二管加入同型对照抗体(PE-MOUSE IgGl/FITC-MOUSE IgGl/APC-Mouse IgGl κ ) 10 μ 1，其余管中加入其它相应抗体10 μ 1，混勻，4°C避光孵育30 分钟，PBS洗涤1次，离心后弃上清，加入500 μ 1 PBS重悬，混勻，即可上机(流式细胞仪 FACSAria, BD公司)检测。细胞免疫表型为⑶29，⑶44，⑶73，⑶90，⑶105为阳性标记， ⑶31，⑶34，HLA-DR为阴性标记(见表1、2)。表1本发明优选检测人脐带胎盘间充质干细胞的表面标志物
权利要求
1.一种人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，它是采用以下工艺方法制备 从保存液取出脐带后，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含抗生素的 Hanks' Balanced Salt Solution中，用D-PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血 管，暴露沃顿胶，然后将脐带剪成l_3mm3大小的组织块后放入试剂瓶，加入质量体积百分 比浓度为0. 的消化液，置于37°C恒温震荡仪内持续消化4 10h，100目筛网过滤，离 心收集细胞；加入HBSS液冲洗细胞3次，用DMEM/F12培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度 4. 8 X IO3 IX 104/cm2，接种于6孔板内，37 °C、体积分数为5% CO2孵箱内培养，24h后换 液，以后每隔3天换液一次，待细胞达到80%融合时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。
2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，制备的间充 质干细胞为脐带沃顿胶、脐带血管周围、脐血和脐静脉血管内皮下的任何一种来源或全部。
3.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述脐带采 用足月剂宫产健康胎儿脐带，并且采集之前产妇已做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、 丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、谷丙转氨酶、支原体检测，并全部。
4.根据权利要求4所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，采集后的脐 带置于4°C保存，6h之内处理。
5.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述D-PBS溶 液不含钙离子和镁离子。
6.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述消化液 中加入II型胶原酶、IV型胶原酶、II型胶原酶和胰酶混合液、或II型胶原酶和透明质酸酶 混合液中的一种。
7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，消化脐带组 织块的时间为他。
8.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基 溶液为无血清DMEM/F12培养基溶液。
9.根据权利要求8所述的人脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基 溶液为含有体积分数为10-20%的FBS和25mmol/L谷氨酰胺的DMEM/F12。
10.如权利要求1 9任一项所述方法制备的间充质干细胞，其特征在于，在免疫学表 型鉴定中，具有以下技术特征①在标准培养条件下贴壁生长于塑料制培养器皿成纤维样生长；②表达粘附分子受体标记物Q^9/CD44，间质细胞标记CD73(SH3)/CD105(Sffi)，及干 细胞标记物⑶90，而低表达或不表达内皮细胞标记物⑶31、造血干细胞标志⑶34和组织相 容性II类抗原HLA-DR ；③体外诱导分化为成骨细胞和心肌样细胞。
全文摘要
本发明公开了一种人脐带间充质干细胞及其制备方法，它是采用足月剂宫产健康胎儿脐带经过无菌处理，机械剪切，暴露沃顿胶，经过胶原酶消化后分离培养而成，经冷冻复苏后细胞活力无明显下降，是细胞治疗的理想种子细胞。本发明还涉及经上述方法制备的原始间充质干细胞，按照国际细胞治疗协会(ISCT)制定的间充质干细胞的标准进行形态学、免疫表型以及体外分化实验鉴定确认为间充质干细胞。其细胞数量、细胞活力、纯度及其倍增时间、增殖能力均明显高于骨髓来源的间充质干细胞。
文档编号C12N5/0775GK102127522SQ20101060554
公开日2011年7月20日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者刘剑, 洪敬欣, 韩俊领 申请人:协和干细胞基因工程有限公司