专利名称：临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗用品的制备，具体是应用于临床治疗用的人脐带间充质干细胞的制备和保存。
背景技术：
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干细胞的一种类型，因能分化为间质组织而得名，是属于中胚层的一类多能干细胞，具有很强的自我更新和向多种组织分化发育的潜能。MSCs主要存在于结缔组织和器官间质中，以骨髓中含量最为丰富，可以向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化，如可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、平滑肌细胞、骨髓基质细胞、成纤维细胞及多种血管内皮细胞，甚至神经系统的神经元和神经胶质细胞，同时还具有免疫调节和促进造血重建等功能，使之成为治疗多系统疾病的“实用型干细胞”。MSCs的多向分化、组织修复和免疫调节功能，使其在临床上具备广泛的应用前景。目前，国内外已将MSCs应用于临床治疗移植物抗宿主病(GVHD)、心血管修复、脊髓损伤、骨和软骨修复、烧伤、类风湿性关节炎、帕金森病等。人们正在继续开展应用MSCs治疗其他疾病的尝试，相信，未来将有更多的疾病可以用MSCs进行治疗。脐带作为间充质干细胞的重要来源，因来源广泛，便于取材，对供者无不利影响， 无伦理道德限制已被人们广泛接受。同时脐带来源的MSCs免疫原性低，异体间移植不会引起排斥反应，避免了因免疫抑制剂使用所带来的副反应，加大了其临床适用范围。因此，脐带MSCs有望被大规模应用于临床研究。目前，间充质干细胞的生物学特性和功能已被人们熟知，如何安全和有效的体外保存、获得、扩增和储存间充质干细胞对于其广泛临床应用具有重要的影响。目前临床治疗用的间充质干细胞研究方面尚存有缺陷。主要包括1脐带采集后脐静、动脉血液凝固，加大了脐带处理的难度，同时血细胞过多增加造血干细胞污染的机会。2酶解法消化组织，增加了临床应用过程中动物源性蛋白引起过敏反应和交叉感染的安全风险。3间充质干细胞培养过程中培养基的选择影响了细胞的扩增效率。4贴壁细胞消化酶解的蛋白浓度影响细胞的存活状态。本发明的目的在于完善上述内容，建立体外脐带的保存方法和间充质干细胞经济、高效的扩增方法，为临床干细胞的研究提供有力保障。
发明内容
本发明目的在于提供一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，克服了之前应用胶原酶和胰蛋白酶等异源蛋白消化法可能带来的风险，降低制备成本，增加间充质干细胞的得率和安全性。本发明的人脐带间充质干细胞的制备方法如下
1.无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含0. 2%庆大霉素、0. 54% 枸橼酸钠抗凝剂的生理盐水保存脐带组织。同时进行病原微生物学和病毒学检测，完全合格后，进行以下步骤。2.将脐带置于含0. 2%庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2-3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块。用剪刀将脐带剪切至 2-3cm大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心 10分钟，弃掉上清，重新加入含0. 2%庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟。3.将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α -MEM(Alpha Minimum Essential Medium)培养基悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，该步骤用以去除大量组织块黏液。4.将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留l-2cm空隙， 置于37°C 5% CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α-MEM培养基。5.每培养3-5天进行半量换液处理。6.于培养第10-12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基， 置于5% CO2培养箱中继续培养。此后1周细胞增长迅速，成为形态较为均一的长梭型细胞， 呈涡旋状生长。7.待涡旋状生长的细胞80%融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含 0.05%胰酶/0.2mM EDTA的消化液消化细胞，按1 3传代，培养条件更换为含10%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基。8.经20-25天扩增后，细胞传至4 5代，可获得大量间充质干细胞。细胞形态如图1所示。9.将步骤7扩增后细胞进行病原生物学检测，同时进行表型检测，表型结果如图 2所示，合格后加入冻存液(培养基胎牛血清DMSO = 5 4 1)，放入细胞冻存盒内，-70°C冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196°C。记录脐带来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期，即可。此脐带间充质干细胞可用于临床治疗。上述操作均在严格无菌条件下进行，脐带采集后抗凝剂的使用有效避免了血液凝固所带来的脐带处理难度和造血干细胞污染的机率。大面积植块培养减少了脐带反复剪切的工作量和污染机会。同时由于在组织块处理过程中，不采用胶原酶和胰蛋白酶等动物源性蛋白的处理，减少了发生污染和过敏反应的机会，且大地降低了制备成本。α -MEM培养基对细胞扩增效率较高。0. 05%胰酶/0. 2mM EDTA的酶解消化方案对细胞的损伤程度较低。本发明的人脐带间充质干细胞制备方法效果优良，可从人脐带中获得大量的 MSCs,而且简单易行，成本低，安全性好，具有良好的应用前景。
图1脐带来源的MSC的形态脐带来源的MSC细胞传第五代第2天的形态(HE染色)，A是10倍物镜下的形态，B是40倍物镜下的形态。图2脐带来源的MSC表型其表型特征为⑶31、HLA_DR、⑶34和⑶45阴性，⑶四、 CD44、CD73、CD90 和 CD105 阳性。
具体实施例方式以下通过实例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1 1.无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，约30CM长，用含0. 2%庆大霉素、0. 抗凝剂的生理盐水保存脐带组织。同时进行病原微生物学和病毒学检测，完全合格后，进行以下步骤。2.将脐带置于含0. 2%庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2-3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块。用剪刀将脐带剪切至 2-3cm大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心 10分钟，弃掉上清，重新加入含0. 2%庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟。3.将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，该步骤用以去除大量组织块黏液。4.将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留l-2cm空隙， 置于37°C 5% CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α-MEM培养基。5.每培养3-5天进行半量换液处理。6.于培养第10-12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基， 置于5% CO2培养箱中继续培养。此后1周细胞增长迅速，成为形态较为均一的长梭型细胞， 呈涡旋状生长。7.待涡旋状生长的细胞80%融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含 0. 05%胰酶/0. 2mMEDTA的消化液消化细胞，按1 3传代，培养条件更换为含10%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基。8.经20-25天扩增后，细胞传至4 5代，可获得大量间充质干细胞。9.将步骤7扩增后细胞进行病原生物学检测，同时进行表型检测，表型结果如图 2所示，合格后加入冻存液(培养基胎牛血清DMSO = 5 4 1)，放入细胞冻存盒内，-70°C冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196°C。记录脐带来源信息、 细胞代数、细胞数量以及制备日期，即可。此脐带间充质干细胞可用于临床治疗。实施例21.无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，约40CM长，用含0. 2%庆大霉素、0. 抗凝剂的生理盐水保存脐带组织。同时进行病原微生物学和病毒学检测，完全合格后，进行以下步骤。2.将脐带置于含0. 2%庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2-3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块。用剪刀将脐带剪切至 2-3cm大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心 10分钟，弃掉上清，重新加入含0. 2%庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟。3.将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，该步骤用以去除大量组织块黏液。4.将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留l-2cm空隙， 置于37°C 5% CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α-MEM培养基。5.每培养3-5天进行半量换液处理。6.于培养第8-10天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基， 置于5% CO2培养箱中继续培养。此后1周细胞增长迅速，成为形态较为均一的长梭型细胞， 呈涡旋状生长。7.待涡旋状生长的细胞80%融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含 0. 05%胰酶/0. 2mMEDTA的消化液消化细胞，按1 3传代，培养条件更换为含10%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基。8.经20-25天扩增后，细胞传至4 5代，可获得大量间充质干细胞。9.将步骤7扩增后获得进行病原生物学检测，同时进行表型检测，表型结果如图 2所示，合格后加入冻存液(培养基胎牛血清DMSO = 5 4 1)，放入细胞冻存盒内，-70°C冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196°C。记录脐带来源信息、 细胞代数、细胞数量以及制备日期，即得。此脐带间充质干细胞可用于临床治疗。
权利要求
1.一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，经过以下步骤1).无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，用含0.2%庆大霉素、0. 枸橼酸钠抗凝剂的生理盐水保存脐带组织，2).将脐带置于含0.2%庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2-3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块，用剪刀将脐带剪切至2-3cm 大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含0. 2%庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，3).将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基悬浮， 充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，4).将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留l-2cm空隙，置于37°C 5% CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α-MEM培养基，5).每培养3-5天进行半量换液处理，6).于培养第10-12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基，置于5% CO2培养箱中继续培养，成为形态较为均一的长梭型细胞，呈涡旋状生长，7).待涡旋状生长的细胞80%融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含0.05% 胰酶/0.2mM EDTA的消化液消化细胞，按1 3传代，培养条件更换为含10 %胎牛血清、 0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基，8).经20-25天扩增后，细胞传至4 5代，可获得大量间充质干细胞，9).将扩增后细胞加入培养基胎牛血清DMSO= 5:4:1的冻存液，放入细胞冻存盒内，-70°C冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，置于液氮中保存即可。
2.一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，经过以下步骤1).无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，30CM长，用含0.2%庆大霉素、 0. 抗凝剂的生理盐水保存脐带组织，2).将脐带置于含0.2%庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2-3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块，用剪刀将脐带剪切至2-3cm 大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含0. 2%庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，3).将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-ΜΕΜ培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，4).将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留l-2cm空隙，置于37°C 5% CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α-MEM培养基，5).每培养3-5天进行半量换液处理，6).于培养第10-12天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-MEM培养基，置于5% CO2培养箱中继续培养，成为形态较为均一的长梭型细胞，呈涡旋状生长，7).待涡旋状生长的细胞80%融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含0.05% 胰酶/0.2mMEDTA的消化液消化细胞，按1 3传代，培养条件更换为含10 %胎牛血清、 0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基，8).经20-25天扩增后，细胞传至4 5代，获得大量间充质干细胞，9).将扩增后细胞加入培养基胎牛血清DMSO= 5:4:1的冻存液，放入细胞冻存盒内，-70°C冰箱放置隔夜后置于液氮中保存即可。
3. 一种以脐带为来源的间充质干细胞的制备方法，其特征在于，经过以下步骤1).无菌条件下采集正常顺产或剖腹产者胎儿脐带，40CM长，用含0.2%庆大霉素、 0. 抗凝剂的生理盐水保存脐带组织，2).将脐带置于含0.2%庆大霉素的生理盐水中，反复冲洗2-3次，用无菌剪刀剪断脐静、动脉血管，剔除肉眼可见的血管组织和可能存在的血凝块，用剪刀将脐带剪切至2-3cm 大小，收集组织块置于50ml离心管内，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，弃掉上清，重新加入含0.2%庆大霉素的生理盐水，将沉淀的组织块充分振荡，使之松散，高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，3).将步骤2所获的组织块用含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-ΜΕΜ培养基内悬浮，充分振荡后高速离心，离心机转速为2000转/分钟，离心10分钟，4).将步骤3所获的脐带组织块平铺于塑料培养瓶内，各组织块间存留l-2cm空隙，置于37°C 5% CO2培养箱内60分钟，待组织块完全贴壁后，补加含15%胎牛血清、0. 2%庆大霉素的α-MEM培养基，5).每培养3-5天进行半量换液处理，6).于培养第8-10天左右在倒置显微镜下观察到组织块周围出现贴壁、梭型或多角型细胞时，将组织块全部吸出，补加含15%胎牛血清、0.2%庆大霉素的α-ΜΕΜ培养基，置于 5% CO2培养箱中继续培养，成为形态较为均一的长梭型细胞，呈涡旋状生长，7).待涡旋状生长的细胞80%融合后，先用生理盐水反复冲洗培养瓶3次，用含0.05% 胰酶/0.2mMEDTA的消化液消化细胞，按1 3传代，培养条件更换为含10 %胎牛血清、 0. 2%庆大霉素的α -MEM培养基，8).经20-25天扩增后，细胞传至4 5代，获得大量间充质干细胞，9).将扩增后加入培养基胎牛血清DMSO= 5:4:1的冻存液，放入细胞冻存盒内，-70°C冰箱放置隔夜后置于液氮中保存即得。
全文摘要
本发明涉及一种临床治疗用脐带间充质干细胞的制备和保存，其制备方法如下用含0.2％庆大霉素、0.54％抗凝剂的生理盐水保存脐带，将脐带剪切至2-3cm，离心，悬浮，离心，直接贴壁植块培养，加入含15％胎牛血清、0.2％庆大霉素的α-MEM培养基培养，细胞融合后用含0.05％胰酶/0.2mMEDTA的消化液消化，按1∶3传代，传至4～5代，可获得大量间充质干细胞，加入冻存液(培养基∶胎牛血清∶DMSO＝5∶4∶1)后，-70℃冰箱放置隔夜后置于液氮中保存，液氮冷冻温度为-196℃。
文档编号C12N5/0775GK102154200SQ20101058506
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者徐若男, 施明, 王福生 申请人:中国人民解放军第三○二医院