脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞保存液技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞无血清保存液 及其应用。
【背景技术】
[0002] UC-MSCs(脐带间充质干细胞）已广泛应用于细胞移植替代治疗，而移植和替代治 疗中细胞的活性与细胞质量是治疗成功的关键。脐带间充质干细胞培养之后，直至抑制手 术和操作之前，都是采用临床常用细胞保存液对UC-MSCs进行短期保存。其中，在细胞的保 存过程中，为了保证细胞能持续维持细胞代谢以及避免其他各方面伤害等等，在保存液中 都添加有血清作为细胞保护成分。
[0003] 而经过反复的研究和跟踪，由于血清中存在许多未知的成分，包括生长抑制因子、 毒性因子，以及其他的大分子蛋白等等；虽然这些成分之间相互中和，最终细胞的性状保存 后变化较低，但是中间生长抑制因子和毒性因子等多种物质作用于细胞使细胞所产生的应 激反应，并不能当成是没发生过，而这些中间过程可能包含有氧化应激水平的增高、能量代 谢会失衡、ATP水平快速下降等等，这些都会引起细胞活性与质量的明显下降，最终导致在 移植和替代治疗之后不与损伤组织融合并且一段时间之后死亡，影响了治疗效果。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种对移植备用的细胞起到保护作 用，可以长效保持移植细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果的脐带间充质干 细胞无血清保存液。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种脐带间充质干细胞无血清保存液，包括NaCl质量分数为0. 85~0. 92%的生 理盐水，所述生理盐水中还添加有胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的松、亚硒酸钠、腺苷、 N-乙酰半胱氨酸和L-谷氨酰胺。
[0007] 在上述保存液的基础上，本发明还提出将上述保存液用于细胞移植替代治疗中对 脐带间充质干细胞进行保存的应用。
[0008] 相比现有技术的血清保存液，本发明的保存液，尽量减低能够产生多种成分的毒 素伤害的物质来源。采用比较成分较少的功能成分，维系细胞的基本代谢，使其性能比较平 缓，无巨大的变动；这些成分基本又能提供作为一些基本的活性营养物质和能量物质，以维 持较低的代谢水平，使细胞活性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或 者分化等情形，对细胞起到保护作用，可以长效保持移植细胞的活性与质量，提髙移植细胞 治疗的临床效果。
【具体实施方式】
[0009] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0010] 本发明实例提出一种脐带间充质干细胞无血清保存液，采用注射用生理盐水作为 基础（NaCl的质量分数为0. 85~0. 92% )，在其中添加胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的 松、亚硒酸钠、腺苷、N-乙酰半胱氨酸、以及L-谷氨酰胺。
[0011] L-谷氨酰胺（L-glutamine)在氨基酸组分中的有重要作用，谷氨酰胺可以合成核 酸和蛋白质，是细胞生长必需成分，而谷氨酷胺缺乏会使细胞生长不良甚至导致细胞死亡。 所以本发明在保存液中添加一定浓度的L-谷氨酰胺，在保存中满足细胞基本代谢所需的 谷氨酷胺，维持代谢活动处于相对较低的水平，避免胁迫式的进行大量代谢，反而会大大缩 短组织细胞的寿命和活性。同时，本发明中添加L-谷氨酰胺的目的还在于，其在机体内能 参与消化道黏膜黏蛋白构成成分氨基葡萄糖的生物合成，从而促进黏膜上皮组织的修复； 跟踪用于体外之后其可以有助于细胞膜结构的补充和修复功能，避免细胞的裂解死亡；所 以在本发明保存液中使用还能借助其进行细胞的修复功能。
[0012] 而本发明上述亚硒酸钠和N-乙酰半胱氨酸消除保存能引起细胞活性降低或者死 亡的细胞毒素。其中，亚硒酸钠含有的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧 化酶的作用过程，可以促进氢过氧化物代谢，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害，这一 点上对干细胞具有良好的损伤保护作用。相比血清中通过较多天然成分自身相互中和细胞 毒素保护细胞的不同，上述保存液是尽量减低能够产生多种成分的毒素伤害的物质来源， 并且同时消除过氧化氢的伤害，因为是细胞生长和克隆的主要毒性物质，可由培养基中的 酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸盐等产生，引起细胞膜上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化 和DNA损伤而导致细胞死亡。而N-乙酰半胱氨酸是活性氧自由基的清除剂，它可以改善氧 化应激引起的不同种类细胞的损伤；对亚硒酸钠的所减缓之外的其他的氧化损伤等进行弥 补，保证细胞温和的保存环境。
[0013] 在上述细胞能基本稳定存活之后，通过激素的添加从细胞的基本生长、稳定代谢 和凋亡这几方面控制细胞的代谢维持于稳定状态，主要是胰岛素、糖皮质激素、雌激素与孕 激素。其中，胰岛素本身的是血糖调节激素，专用至培养基中之后，能促进细胞利用葡萄糖 和氨基酸的效率，从而提升RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是比较重要的细胞 存活因子，同时还能抑制细胞凋亡。
[0014] 而雌激素与孕激素是两种相互拮抗的激素，体外用于细胞保存时，可以相互调节 和平衡作用于细胞线粒体的有氧呼吸，通过控制有氧呼吸的程度从而抑制细胞过快大量代 谢调亡，同时具有促进UC-MSCs增殖的作用。
[0015] 而糖皮质激素是一种留体类化合物，它能够影响细胞内的三大代谢，同时它具免 疫抑制作用，调节内环境的稳定影响细胞的生长，用于维持和稳定细胞内的代谢环境水平。
[0016] 氢化可的松也是激素，是一种糖皮质激素，具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克 及一定的盐皮质激素活性等；用在细胞保存液中，首先可以免疫抑制和抗毒作用，可以避免 细胞进一步自身抗毒和免疫反应，从而降低了细胞自身产生性状变异和分化的情形。
[0017] 在上述基础上，还添加腺苷（Adenosine，Ado)，其是一种内源性核苷，它是产生 ATP的前体物质同时也是ATP的代谢产物，腺苷能够通过调控细胞内ATP水平，是尽量避免 细胞内大量ATP代谢，避免强烈的代谢会造成细胞自身性状的变化过大，对细胞具有保护 作用。
[0018] 同时，采用的作为保存液的基础是NaCl质量分数为0.85~0.92%的注射用生理 盐水，一方面可以利用无机离子提供保存液中的离子强度，用于提供细胞外渗透压，避免在 保存过程中发生水的跨膜移动，从而破坏细胞内的体液容量平衡和细胞形态变化。而更主 要地，Na+阳离子有利于维持细胞间的信息传递，利于维持细胞的活性，因为本身阳离子对 于组织细胞来说，需要通过相应的运载和信号蛋白才能被细胞接收，是属于高度不通透的， 所以细胞膜对于这些需要主动识别和运载的阳离子相比水分子等非电解质更加敏感，可以 刺激脐带间充质干细胞膜的通透性变化，使细胞自身能具有良好的应变能力。
[0019] 根据细胞最佳的渗透压耐受范围260~320mmol/L，采用质量分数0. 85~0. 92% 的NaCl，同时进一步控制各成分的用量；首先，激素是一些特定功能细胞代谢的产物，如 果大量添加那么会导致干细胞向相应类型的细胞进行诱导和分化，所以这一种情形中控 制其量使其满足促进生长而避免诱导的发生，添加在基础培养基中之后，胰岛素浓度控制 0. 08~0. 12yg/L、雌激素浓度控制10 7~10smol/L、孕激素浓度控制10 7~10smol/L、 氢化可的松浓度控制10 5~10 6mol/L、腺苷的浓度控制为0. 4~0. 6mmol/L。
[0020] 进一步，其中亚硒酸钠和N-乙酰半胱氨酸的结合，能满足相应的基本功能即可， 因此控制亚硒酸钠浓度20~35nmol/L、N-乙酰半胱氨酸的浓度控制0. 9~1. 2mmol/L。
[0021] L-谷氨酰胺添加量加大之后，其会促进细胞自身进行大量的核酸和蛋白质合成， 而保存液中并没有提供细胞进行大量合成这些大分子的原料，而刺激产生了相应的酶之后 细胞内代谢趋势会被改变，所以避免胁迫式代谢L-谷氨酰胺的浓度控制0. 4~0. 6mmol/L， 保证细胞内温和的保存环境。
[0022] 本发明的上述脐带间充质干细胞保存液，相比血清的保存液，将其中的功能成分 进行删减，上述保存液是尽量减低能够产生多种成分的毒素伤害的物质来源。采用比较成 分较少的功能成分，维系细胞的基本代谢，使其性能比较平缓，无巨大的变动；这些成分基 本又能提供作为一些基本的活性营养物质和能量物质，以维持较低的代谢水平，使细胞活 性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，对细胞起到保 护作用，可以长效保持移植脐带细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果。
[0023] 在上述保存液的基础上，本发明还提出采用上述脐带间充质干细胞无血清保存液 对脐带间充质干细胞进行保存中的应用。采用上述保存液进行脐带间充质干细胞进行保 存，对细胞起到保护作用，可以长效保持移植脐带细胞的活性与质量，使细胞活性处于较稳 定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，提髙移植细胞治疗的临床 效果。
[0024] 为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解 和实施参考，同时凸显出本发明的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。
[0025] 实施例1
[0026] S10,获取脐带：无菌条件下取健康足月剖腹产儿的近胎儿段脐带，挤净挤血后将 挤带轻轻放入内含