脐带间充质干细胞对百草枯中毒肺损伤的治疗作用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及使用间充质干细胞治疗肺损伤，尤其涉及使用脐带间充质干细胞治疗百草枯中毒肺损伤。
【专利说明】脐带间充质干细胞对百草枯中毒肺损伤的治疗作用
【技术领域】
[0001]本发明涉及充质干细胞治疗领域，尤其涉及脐带间充质干细胞对百草枯中毒肺损伤的治疗。
【背景技术】
[0002]百草枯(Paraquat，PQ)是一种广泛使用的高效除草剂，对人有较强的毒性作用。由于其中毒致死量小、无特效解毒剂、常规对症治疗效果极差，故死亡率居高不下。百草枯中毒的特征性改变是肺损伤，早期表现为肺泡上皮细胞受损，肺泡内出血水肿，晚期则表现为肺泡内和肺间质纤维化。
[0003]近年来随着干细胞研究的进展，干细胞在临床难治性和顽固性疾病治疗方面的研究越来越多。间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)因取材方便、再生能力强、细胞增殖快、操作简单等优点而广受青睐。已有研究1显示，MSCs可被募集到肺损伤部位，分化并修复肺泡上皮细胞，增加表面活性物质分泌，减轻炎症反应，具有治疗肺损伤的巨大潜力。本研究探讨脐带来源间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC)治疗百草枯中毒性肺损伤的可行性，旨在为百草枯中毒的临床治疗开拓新的途径。
[0004]以往的文献报道，MSC对博莱霉素诱导的肺纤维化有治疗作用。但目前尚未见到采用MSC治疗百草枯中毒诱导的肺纤维化的研究。不同原因引起的肺纤维化机理不同。MSC能否用于治疗百草枯中毒诱导的急性肺损伤以及能否阻止百草枯中毒后存活的病人的肺纤维化，是无法预 料的。
【发明内容】
[0005]本研究首次发现脐带MSC对百草枯中毒诱导的肺纤维化有治疗作用，动物死亡率下降，肺纤维化评分下降。本研究探讨了脐带MSC对急性肺损伤生存率的改善，发现对于较低剂量百草枯中毒改善明显，而较高剂量时效果不好。因此，本研究表明临床应用干细胞进行百草枯中毒病人的救治需要选择病例；同时探讨了细胞移植时间对疗效的影响，发现24小时输注细胞效果较好，从而为MSC应用于临床时治疗方案的制定有指导意义。由于百草枯中毒后存活的病人具有肺纤维化的远期并发症，因此本研究为临床改善病人长远的生存质量提供了新的治疗方法。
[0006]本发明的目的在于使用脐带间充质干细胞治疗中毒肺损伤，尤其是百草枯中毒肺损伤。
[0007]在一些实施方案中，所述脐带间充质干细胞的剂量为IxlO6~IxlO8细胞/kg体重。
[0008]在一些优选实施方案中，所述脐带间充质干细胞的剂量为5xl06~5xl07细胞/kg体重。
[0009]在一些更优选的实施方案中，所述脐带间充质干细胞的剂量为IxlO7~2.5xl07细胞/kg体重。[0010]在一些实施方案中，所述百草枯中毒中的百草枯剂量为I~59mg/kg体重。
[0011]在一些优选实施方案中，所述百草枯中毒中的百草枯剂量为10~50mg/kg体重。
[0012]在一些更优选的实施方案中，所述百草枯中毒中的百草枯剂量为20~40mg/kg体重。
[0013]在一些实施方案中，中所述脐带间充质干细胞的输注时间为中毒后24小时。
[0014]在一些实施方案中，所述药物除含有脐带间充质干细胞外，还含有辅助药物。
[0015]在具体实施方案中，所述辅助药物可为糖皮质激素例如地塞米松或甲基强的松龙。
[0016]本发明的有益效果为:首次发现脐带MSC对百草枯中毒诱导的肺纤维化有治疗作用，动物死亡率下降，肺纤维化评分下降。发现了脐带MSC对急性肺损伤生存率的改善，对于较低剂量百草枯中毒改善明显，而较高剂量时效果不好。因此，本研究表明临床应用干细胞进行百草枯中毒病人的救治需要选择病例；同时探讨了细胞移植时间对疗效的影响，发现24小时输注细胞效果较好，从而为MSC应用于临床时治疗方案的制定有指导意义。这在以往的研究中未见阐述。由于百草枯中毒后存活的病人具有肺纤维化的远期并发症，因此本研究为临床改善病人长远的生存质量提供了新的治疗方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为急性百草枯中毒性肺损伤HE染色。左:PBS组；右=UCMSC组。
[0018]图2为UCMSC对百草枯中毒性肺纤维化的治疗作用的统计结果。
[0019]图3为UCMSC治疗百草枯中毒性肺纤维化HE染色。左:PBS组；右=UCMSC组。
[0020]图4为图4UCMSC移植后不同时间点肺组织人特异性基因CBM检测。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0022]实施例
[0023]材料与方法
[0024]1.动物
[0025]健康成年雌性C57BL/6小鼠，体重19_21g，于屏障环境内活动，室内恒温恒湿，人工照明12h/d，自由进食水，实验前适应性饲养I周。
[0026]2.UCMSC的分离、培养、鉴定
[0027]UCMSC取空军总医院健康胎儿，签署知情同意书，无感染性疾病。脐带样品冲洗干净，剪成2-3mm3的小块，加入1%胶原酶消化液37°C消化2h，用70 μ m筛网过滤，收集上清，离心收集细胞。用PBS清洗 后，加入5mL培养液重悬细胞，370C，5%C02培养箱培养。80%_90%汇合时，按1:2或1:3比例传代。动物体内移植采用6-8代细胞。采用流式细胞仪检测MSC表面标志的表达。
[0028]3.百草枯中毒性肺损伤模型的制备
[0029]动物适应性饲养一周后一次性腹腔注射40mg/kg百草枯溶液，注射液体量为0.2ml/10g。急性肺损伤动物模型于造模后7天处死；肺纤维化模型于造模后21天处死。
[0030]4.动物分组
[0031]105只动物，根据百草枯给药剂量(40mg/kg,50mg/kg,60mg/kg)以及是否输注UCMSC 进行治疗分为 6 组:40mg/kg-PBS 组(n=30) ；40mg/kg-UCMSC 组(n=29) ；50mg/kg-PBS组(n=13) ；50mg/kg-UCMSC 组(n=13) ；60mg/kg-PBS 组(n=10) ;60mg/kg_UCMSC 组(n=10)。PBS组于百草枯造模后24小时尾静脉注射PBS ;UCMSC组于造模后24小时尾静脉输注IxlO7细胞/kg体重的UCMSC。其中40mg/kg-PBS组和40mg/kg_UCMSC组各取14只于21天处死，观察UCMSC对百草枯诱导肺纤维化的治疗作用；其余动物7天处死，观察UCMSC对急性肺损伤的治疗作用。记录死亡率和体重变化，并取肺组织进行病理包埋和切片，病理评分。
[0032]5.肺组织病理切片染色及评分
[0033]肺组织切片进行常规HE染色，按照急性肺损伤或肺纤维化评分标准进行评分。
[0034]急性肺损伤评分标准参照文献2，病理评分范围为0-16分，具体如下表:
[0035]表1急性肺损伤评分标准
【权利要求】
1.脐带间充质干细胞在制备治疗百草枯中毒肺损伤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述脐带间充质干细胞的剂量为IxlO6~IxlO8细胞/kg体重。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述脐带间充质干细胞的剂量为5xl06~5xl07细胞/kg体重。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述脐带间充质干细胞的剂量为IxlO7~2.5xl07细胞/kg体重。
5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述百草枯中毒肺损伤中的百草枯中毒剂量为1~59mg/kg。
6.根据权利要求5所述的用途，其中所述百草枯中毒肺损伤中的百草枯剂量为10~50mg/kg.
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述百草枯中毒肺损伤中的百草枯剂量为20~40mg/kg.
8.根据权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述脐带间充质干细胞的输注时间为中毒后24小时。
9.根据权利要求1-8任一项所述的用途，其中所述药物除含有脐带间充质干细胞外，还含有辅助药物。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述辅助药物可为糖皮质激素例如地塞米松或甲基强的松龙。
【文档编号】A61P11/00GK103816186SQ201410072002
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】吕双红, 王慧娜, 杜丽欣, 刘兵 申请人:中国人民解放军军事医学科学院附属医院