一种p28^GANK单克隆抗体及其用途的制作方法

专利名称：一种p28^GANK单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学生物工程技术领域，是一种p28eAffi单克隆抗体及其用于制备肝癌的预后评估制剂或肝癌治疗药物的用途。
背景技术：
p28GANK是存在于人肝细胞中的一种蛋白，通常在正常细胞中含量较少，但在肝癌细胞中含量很高。它的编码框包含2 个氨基酸，分子量为25kDa，含有6个重复ankyrin 序列，GeneID :5716。本发明人曾制备了兔抗人p28eANK多克隆抗体用于肝癌鉴别诊断并申请了专利(详见《肝癌鉴别诊断用P^抗体及其制备》，专利号ZL 03116825. 6)。近来有报道p28GAffi主要是通过调控内质网应激(ER stress)、NF-κ B、P53及Rb 信号通路发挥其促癌作用。？观—直接结合彻认/顺-^加速顺-^出核；P^ganK结合泛素蛋白连接酶MDM2介导p53的泛素化降解；p^GANK结合肿瘤抑制蛋白Rb并驱动Rb的核内磷酸化失活及核转录因子E2F-1释放，加速细胞周期(Gastroenterology 2005 ；128 2029-2041 ；CellResearch 2009Nov ； 19 (11) :1243-57. ；2007Dec ；17 (12) :1020-9)。曾有报道影响肝癌预后的因素主要是肿瘤大小和血管侵犯，并通常伴随肿瘤多发性。目前，越来越多的研究表明预判肝癌的复发尚需发掘其他更为有效的预后因素。以往研究提示p28eAffi在肝癌发生发展中可能发挥了重要作用，但是它如何调控肝癌进程尚不明确，至今未见PZSmm的表达水平可直接作为肝癌复发转移的预后判断因素，以及用于肝癌个性化治疗的相关报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种P^mnk单克隆抗体，并将其用于制备肝癌预后检测试剂或用于制备治疗肝癌的药物。本发明人根据肝癌中MSgam蛋白的高表达现象，研究了 MSgank对肝癌细胞转移能力的调控，通过实验发现，蛋白P^gank可以促进肝癌细胞的转移，即P^gmk能够通过调控 PI3K-AKT-HIF1 α通路促进肝癌的转移，并且p28eAffi蛋白的表达强弱与肝癌患者的预后密切相关。如果用它的单克隆抗体特异识别反映出肝病患者组织样本中p28eANK的本底表达水平，就能对患者的预后作出预判分析；进而设想，如果用相应单克隆抗体抑制p28eAffi功能， 阻断p28eMK的促癌作用，就有可能对那些自身肝脏中P^mnk本底表达水平较高的患者起到个性化的治疗效果。所以P^mnk的单克隆抗体可以用于肝癌的预后判别以及个性化治疗。 本发明制备了 P^mm的单克隆抗体，并提供了新用途。本发明的鼠抗人p28eAffi单克隆抗体的制备方法如下1.针对p28eANK的编码框氨基酸全序列设计并合成3个多肽，序列分别为多肽1:131-145，NPDAKDHYEATAMHRC多肽2 180-194，CDEERVEEAKLLVSQ多肽3 199-214，YIENKEEKTPLQVAKGC ；
2.将上述多肽分别与钥孔慽血兰蛋白(keyholelimpet hemocyanin，KLH)耦联， 作为免疫原免疫小鼠；3.取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；4.经多轮筛选出合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗人PZSmm蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；5.通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人 p28GAffi的单克隆抗体。本发明提供了抗人p28eMK的单克隆抗体，该单克隆抗体识别分别位于p28eAffi氨基酸序列 NPDAKDHYEATAMHRC、CDEERVEEAKLLVSQ 和 YIENKEEKTPLQVAKGC 的抗原表位。本发明中的多肽可用多肽合成仪合成。多肽片段可用戊二醛连接法等与KLH等载体蛋白耦联，作为免疫原免疫小鼠，并用于单克隆抗体筛选。抗人p28eANK的单克隆抗体的杂交瘤细胞株可采用本技术领域常规的方法制备。比如，取经免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞如SP2/0细胞融合，经筛选后即可获得杂交瘤细胞。单克隆抗体的获得可采用本技术领域常规的方法，即通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞并产生腹水抗体，取出腹水经纯化而得到。本发明的杂交瘤细胞株，也称杂交瘤细胞系160CT8531和161CT7112，所制备的单克隆抗体是一种免疫球蛋白，可特异性结合人p28eMK蛋白。经鉴定，所制备的免疫球蛋白是 IgG型的单克隆抗体。本发明还提供了上述抗人p28eAffi的单克隆抗体在检测肝病患者预后判别中的应用，其中的检测是指Western Blot和免疫组化检测。本发明为P^mnk的临床个性化治疗应用提供了新的思路。


图1.是单克隆抗体Western Blot检测人p28GAffi蛋白的扫描图。其中，泳道1，3，5是肝癌细胞SMMC-7721裂解液，泳道2，4，6是含有外转 myc-p28GANK的细胞系SMMC_7721-p^GANK裂解液。一标识的是外源性p28GAffi。图2.是单克隆抗体p28GAffi免疫组化检测人P^gank蛋白的组织切片图，其中，A为单克隆抗体160CT8531免疫组化检测的肝癌组织Q00X)；B为单克隆抗体161CT7112免疫组化检测的肝癌组织Q00X)。图3.是单克隆抗体P^gank免疫组化检测200例人肝癌样本中P^gank表达水平后统计分析对患者预后(无瘤生存率Disease-Free Survival和总生存率Overall Survival)的曲线图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。实施例1.抗人p28eAffi的单克隆抗体的制备和纯化1.抗原的合成和耦联抗原多肽合成设计参考GenBank，GeneID :5716，具体序列% NPDAKDHYEATAMHRC (SEQ ID NO 1) , CDEERVEEAKLLVSQ (SEQ ID NO :2)， YIENKEEKTPLQVAKGC(SEQ ID NO :3)，由百奇生物科技(上海)有限公司通过多肽自动合成仪用固相多肽合成法合成。多肽与钥孔慽血兰蛋白(KLH)的耦联采用《分子克隆实验指导》第2版，萨姆布鲁克著，金冬雁译，科学出版社，北京，1999，第865页描述的戊二醛连接法。2.单克隆抗体的制备和纯化将上述1中纯化的多肽KLH偶联物100 μ g以PBS稀释后与等体积完全弗氏佐剂 (CFA)混勻乳化，免疫5-6周龄的雌性BALB/c小鼠5只，双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后双腿进行肌肉注射，每个区域大约用1/8的免疫原，将剩余免疫原的1/2进行腹腔注射。 1周后加强免疫50 μ g，完全弗氏佐剂，腹腔注射。2周后加强免疫50 μ g，不完全弗氏佐剂 (IFA)，腹腔注射。3周及以后，每周直接腹腔注射50 μ g加强免疫。第5周起，每周尾静脉采血，ELISA测定效价，应用多肽KLH偶联物抗原1. 25 μ g/ml包被，10% FCS封闭，将血清稀释后加入，应用羊抗小鼠IgG标记HRP作为二抗，OPD显色，使用酶标仪(Bio-Rad550型) 在492nm读数。第4次采血的ELISA结果OD值均大于0. 75。取传染了人p28GAM蛋白的稳定细胞系SMMC-7721/p28GANK 1 X IO6个，用细胞裂解液裂解后，常规flfestern Blot检测。在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(购自ATCC)。最后一次加强免疫3天后，取Wfestern Blot和免疫组化检测效果最好的小鼠的脾细胞，与SP2/0细胞比例5 1，在PEG1500的作用下进行融合反应，植入96孔板，37°C、5% CO2条件下培养。培养14天后，镜下检测生长出克隆细孔为融合阳性孔，计算总融合率>95%。尽量选择单克隆细胞孔的上清进行ELISA检测。ELISA阳性的克隆用Western Blot和免疫组化检测 SMMC-7721/p28GANK细胞，筛选出来的克隆亚克隆两次，每次flfestern Blot和免疫组化检测效果最好的克隆。筛选得到3个克隆。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠用石蜡油腹腔注射10天后，取杂交瘤细胞以2X106 个细胞/只进行腹腔注射。7-14天后从小鼠腹腔抽出富含抗体的腹水进行检测和纯化。纯化采用ftOteinG亲和层析法。ftOteinG亲和层析柱用PBS平衡柱子后取腹水过柱，然后用PBS洗柱至OD值接近零，以50nmol/L的甘氨酸盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，透析纯化。实施例2.抗人p28eAffi的单克隆抗体的鉴定和检测应用1.单克隆抗体的Wfestern Blot检测应用变性的蛋白样品进行SDS-PAGE蛋白电泳；通过电转仪将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Schleicher&Schell 公司)；含 5% BSA 的 TBST 封闭 lh，TBST 洗一次，5min ；含 4% BSA 的TBST稀释抗p28GAM单克隆抗体一抗(1 μ g/ml)，孵育浊，TBST洗三次，每次5min ；含4% BSA的TBST稀释IR-800标记的抗小鼠二抗，孵育lh，TBST洗四次，每次5min ；用红外线激光扫描仪Odyssey扫描。结果见图1。结果表明该单克隆抗体能较为特异地识别人p28eMK 分子。2.单克隆抗体的免疫组化检测应用切片置于60°C恒温箱中烘烤20分钟并脱蜡；3% H2O2 (80%甲醇)室温10分钟灭活内源性过氧化物酶，PBS洗3次各5分钟。0. OlM枸橼酸钠缓冲液(pH6. 0)高压修复抗原，PBS洗3次各5分钟；山羊血清封闭，室温20分钟，甩去多余液体；滴加以抗体稀释液稀释的抗p28GAM单克隆抗体一抗(10 μ g/ml)，室温孵育池，PBS洗3次各5分钟；滴加HRP标记的二抗50 μ 1，室温孵育lh，PBS洗3次各5分钟；DAB显色5_10分钟，在显微镜下掌握染色程度，PBS洗3次各5分钟；苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化，自来水冲洗10-15分钟； 脱水、透明、封片、拍照。结果见图2。结果表明，该单克隆抗体能较为特异地识别人PZSmm分子。3.抗人p28eANK单克隆抗体针对肝癌患者的预后判断应用①运用肝癌组织芯片(其中包含随机选取2001年-2006年在上海东方肝胆外科医院行肝癌根治术的原发性肝细胞癌患者标本200例)，相应标本具有完善病史及随访资料记录入选患者的性别、年龄，肿块大小、肿块象限、具体病理亚型、免疫组化结果、淋巴结转移、门脉癌栓、肝内血管侵犯等情况。记录术后无瘤生存时间(Disease-Free Survival, DFS)、总生存时间(Overall Survival, OS)及复发转移情况。②p28GAffi表达检测及评估利用免疫组化方法检测组织芯片中P^gam的表达情况，计算出每张照片中p28eAffi的表达强度，并通过计算得出每位患者癌及癌旁组织中p28eMK 的平均表达强度。利用统计软件分析p28eMK的表达与肝癌患者各种临床特征及预后参数 (总生存率、无瘤生存率、总生存时间、无瘤生存时间等)的关系，制成曲线图，结果见图3。 结果表明，该抗体检测到的样本本底p28eAffi的表达强弱与患者预后密切相关。
权利要求
1.一种抗人p28eANKm单克隆抗体的制备方法，步骤如下a)合成作为半抗原的多肽，其序列如SEQID NO :1_3所示；b)将上述多肽与匙孔慽血蓝蛋白KLH偶联，作为免疫原免疫小鼠；c)取免疫鼠的脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合；d)经多轮筛选出与合成多肽反应阳性的细胞克隆，作为抗人p28eAffi单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株保藏号为；e)通过在小鼠体内接种杂交瘤细胞产生腹水抗体，将腹水进行纯化，得到抗人p28eMK 的单克隆抗体；或者通过体外细胞培养，分离纯化，得到抗人p28eANK的单克隆抗体。
2.权利要求1所述方法制备的抗人p28eAffi的单克隆抗体。
3.权利要求2所述的抗人p28GANK的单克隆抗体在制备肝癌患者预后评估分析Western Blot和免疫组化检测试剂中的应用。
4.权利要求2所述的抗人p28eMK单克隆抗体在制备治疗肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医学生物工程技术领域，是一种p28GANK单克隆抗体及其用于制备肝癌的预后评估制剂或肝癌治疗药物的用途。p28GANK蛋白在肝癌细胞中表达异常升高，并且其表达强弱与患者预后密切相关，因此p28GANK在肝癌发生发展中的作用已被日益重视。本发明提供了抗人p28GANK的单克隆抗体，还提供了该抗人p28GANK的单克隆抗体在检测判别肝癌患者预后分析和个性化治疗中的应用价值。本发明为p28GANK的临床个性化治疗应用提供了新的思路。
文档编号C12N5/18GK102532313SQ201010585000
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者付静, 王红阳, 罗韬, 胡栋平, 董立巍, 陈瑶 申请人:中国人民解放军第二军医大学