一种泛一、二甲基化抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种泛一、二甲基化抗体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]赖氨酸可发生甲基化修饰，包括一，二，三甲基化修饰，过去的研究更多得是关注组蛋白的赖氨酸甲基化修饰。但是最近越来越多的证据表明，非组蛋白上的赖氨酸也可以发生甲基化修饰，并且这些甲基化修饰在疾病的发生与发展中也起着重要作用，因此鉴定非组蛋白上的赖氨酸甲基化修饰也显得至关重要，这需要有效的方法富集甲基化的蛋白进行质谱分析鉴定，其中最主要的方法是用抗体富集。
[0003]目前，世界上还没有特异性很好的泛一二甲基化抗体。因此，研发新型的泛一二甲基化抗体显得至关重要。本发明采用一种全新的泛一二甲基化抗体制备方式，并且用多个甲基化的组蛋白多肽进行了验证，均发现了良好的特异性识别。
【发明内容】
[0004]为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种新型的泛一、二甲基化抗体及其制备方法，以解决目前没有特异性识别三甲基化蛋白抗体的问题。
[0005]常规的抗体制备方法都是把抗原偶联到牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)或卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)或血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin, KLH)或牛甲状腺球蛋白(Bovine Thyroglobulin, THY)，再以这个偶联蛋白作为抗原底物免疫兔子得到抗体血清。本发明提供的新型的泛一、二甲基化抗体的制备方法，直接用载体蛋白，如牛血清白蛋白或卵清蛋白或血蓝蛋白或牛甲状腺球蛋白，作为免疫抗原前提底物，用烷基化试剂(2-氯乙基)-甲基氯化钱((2-chloroethy I)-me thy lammonium chloride)和(2-氯乙基)-二甲基氯化钱((2-chloroethyl)-dimethylammonium chloride)通过化学修饰的方法把载体蛋白中的半胱氨酸进行烷基化修饰分别模拟成一甲基化修饰赖氨酸(记为Kc[mel])和二甲基化修饰赖氨酸(记为Kc [me2])(如图1);再以这个富含模拟的一甲基化修饰赖氨酸的载体蛋白(Kc [meI ])和二甲基化修饰赖氨酸的载体蛋白(Kc [me2 ])混合物作为免疫抗原底物，免疫兔子，得到特异性识别一二甲基化蛋白抗体。
[0006]具体操作流程如下:
一:制备把半胱氨酸模拟成一甲基化修饰赖氨酸(Kc [mel])的载体蛋白1:称取10-50mg载体蛋白溶解到烷基化试剂中，该试剂主要成分为:4_羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、盐酸狐(Guanidinium chloride)、L-甲硫氨酸(D/L-meth1nine))；
2:向上述载体蛋白溶液中加入1-1Omg二硫苏糖醇(DTT)，进行反应；
3:再加入与载体蛋白等量(S卩10-50mg)的(2-氯乙基)-甲基氯化铵进行烷基化反应；
4:补充加入1-1Omg的二硫苏糖醇(DTT)，继续反应；
5:加入20-200ul巯基乙醇(BME)终止反应，得到模拟一甲基化修饰的载体蛋白(Kc[mel])； 二:制备把半胱氨酸模拟成二甲基化修饰赖氨酸(Kc[me2])的载体蛋白1:称取10-50mg载体蛋白溶解到烷基化试剂中，该试剂主要成分为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、盐酸胍、L-甲硫氨酸；
2:向上述载体蛋白溶液中加入1-1Omg二硫苏糖醇(DTT)，进行反应；
3:再加入与载体蛋白等量(S卩10-50mg)的(2-氯乙基)-二甲基氯化铵进行烷基化反应；
4:加入1-1Omg二硫苏糖醇(DTT)，继续反应；
5:再加入与载体蛋白等量(S卩10-50mg)的(2-氯乙基)-二甲基氯化铵，继续烷基化反应；
6:加入20-200ul巯基乙醇(BME)终止反应，得到模拟二甲基化修饰的载体蛋白(Kc[me2])；
三:混合载体蛋白(Kc[mel])和载体蛋白(Kc[me2])，取混合物免疫兔子，得到血清抗体，即泛一、二甲基化抗体。
[0007]用泛一二甲基化抗体与多个组蛋白甲基化修饰的多肽进行免疫沉淀实验(Immunoprecipitat1n, IP)并进行蛋白质印迹(Western Blot, WB)检测，结果显示得到的血清抗体可以特异得识别一二甲基化修饰的组蛋白多肽而几乎不识别零甲基化，或者三甲基化修饰的组蛋白多肽(如图2)。
[0008]与现有技术相比，本发明的有益效果是该抗体可以特异地识别一、二甲基化修饰的组蛋白多肽，而对零甲基化修饰和三甲基化修饰的组蛋白多肽几乎不识别，如图2，图3所不O
[0009]同时，该泛一二甲基化抗体也可以特异识别泛一二甲基化修饰的非组蛋白。
【附图说明】
[0010]图1为(2-氯乙基)-甲基氯化铵烷基化修饰半胱氨酸得到模拟修饰的一甲基化修饰赖氨酸和(2-氯乙基)_ 二甲基氯化铵烷基化修饰半胱氨酸得到模拟修饰的二甲基化修饰赖氨酸的原理。
[0011]图2和图3为免疫兔子得到的泛一二甲基化抗体，用多个组蛋白修饰的多肽和抗体进行免疫沉淀实验(IP)并进行蛋白质印迹(WB)检测。结果显示得到的血清抗体可以特异识别三甲基化修饰的组蛋白多肽，而几乎不识别零甲基化，一甲基化或者二甲基化修饰的组蛋白多肽。
【具体实施方式】
[0012]下面通过具体实施例进一步描述本发明。
[0013]实施例1
一:制备把半胱氨酸模拟成一甲基化修饰赖氨酸(Kc [me I ])的牛血清白蛋白BSA1:称取1mg BSA牛血清白蛋白BSA溶解到900ul烷基化试剂(1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，PH7.8; 4M盐酸胍1mM L-甲硫氨酸);
2:加入20ul IM的二硫苏糖醇(DTT)，37°C反应I小时；
3:加入10ul IM (2-氯乙基)-甲基氯化铵，室温烷基化反应4小时；
4:加入1ul IM二硫苏糖醇(DTT)，室温反应10小时； 5:加入50ul 14.2M巯基乙醇(BME)终止反应得到模拟一甲基化修饰的牛血清白蛋白BSA(Kc[mel])0
[0014]二:制备把半胱氨酸模拟成二甲基化修饰赖氨酸(Kc [me2 ])的牛血清白蛋白BSA
1:称取1mg BSA牛血清白蛋白BSA溶解到930ul烷基化试剂(1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，PH7.8; 4M盐酸胍1mM L-甲硫氨酸);
2:加入20ul IM的二硫苏糖醇(DTT)，37°C反应I小时；
3:加入50ul IM (2-氯乙基)-二甲基氯化铵，室温烷基化反应2小时；
4:加入1ul IM 二硫苏糖醇(DTT)，室温反应30分钟；
5:加入50ul IM (2-氯乙基)-二甲基氯化铵，室温烷基化反应2小时；
6:加入50ul 14.2M巯基乙醇(BME)终止反应得到模拟二甲基化修饰的牛血清白蛋白BSA(Kc[me2])0
[0015]三:1:1混合BSA(Kc[mel])和BSA(Kc[me2])，取0.5mg免疫兔子，每一个半月免疫一次，6个月后得到血清抗体，即Pan-me I / 2抗体。
[0016]用泛一二甲基化抗体与多个组蛋白甲基化修饰的多肽进行免疫沉淀实验(IP)并进行蛋白质印迹(WB)检测，结果显示得到的血清抗体可以特异得识别一二甲基化修饰的组蛋白多肽而几乎不识别零甲基化，或者三甲基化修饰的组蛋白多肽(如图2)。
[0017]实施例2
一:制备把半胱氨酸模拟成一甲基化修饰赖氨酸(Kc [mel])的血蓝蛋白KLH1:称取1mg血蓝蛋白KLH溶解到900ul烷基化试剂(1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，PH7.8; 4M盐酸胍1mM L-甲硫氨酸);
2:加入20ul IM的二硫苏糖醇(DTT)，37°C反应I小时；
3:加入10ul IM (2-氯乙基)-甲基氯化铵，室温烷基化反应4小时；
4:加入1ul IM二硫苏糖醇(DTT)，室温反应10小时；
5:加入50ul 14.2M巯基乙醇(BME)终止反应得到模拟一甲基化修饰的血蓝蛋白KLH(Kc[mel])ο
[0018]二:制备把半胱氨酸模拟成二甲基化修饰赖氨酸(Kc [me2 ])的血蓝蛋白KLH
1:称取1mg血蓝蛋白KLH溶解到930ul烷基化试剂(1M 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，PH7.8; 4M盐酸胍1mM L-甲硫氨酸);
2:加入20ul IM的二硫苏糖醇(DTT)，37°C反应I小时；
3:加入50ul IM (2-氯乙基)-二甲基氯化铵，室温烷基化反应2小时；
4:加入1ul IM 二硫苏糖醇(DTT)，室温反应30分钟；
5:加入50ul IM (2-氯乙基)-二甲基氯化铵，室温烷基化反应2小时；
6:加入50ul 14.2M巯基乙醇(BME)终止反应得到模拟二甲基化修饰的血蓝蛋白KLH(Kc[me2])。
[0019]三:1:1混合血蓝蛋白KLH (Kc[mel])和血蓝蛋白KLH (Kc[me2])，取0.5mg免疫兔子，每一个半月免疫一次，6个月后得到血清抗体，即泛一二抗体。
[0020]用泛一二甲基化抗体与多个组蛋白甲基化修饰的多肽进行免疫沉淀实验(IP)并进行蛋白质印迹(WB)检测，结果显示得到的血清抗体对一二甲基化修饰的组蛋白多肽有较强的识别(如图3)。
【主权项】
1.一种泛一、二甲基化抗体的制备方法，其特征在于具体步骤为: (1)直接用多肽偶联载体蛋白:牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或牛甲状腺球蛋白，作为免疫抗原前提底物，用烷基化试剂(2-氯乙基)-甲基氯化铵和(2-氯乙基)-二甲基氯化铵通过化学修饰把载体蛋白中的半胱氨酸进行烷基化修饰分别模拟成一甲基化修饰赖氨酸(记为Kc[mel ])和二甲基化修饰赖氨酸记为(Kc[me2]); (2)再以这个富含模拟的一甲基化修饰赖氨酸的载体蛋白(Kc[meI])和二甲基化修饰赖氨酸的载体蛋白(Kc[me2])混合物作为免疫抗原底物，免疫兔子，得到特异识别一二甲基化蛋白抗体。2.根据权利要求1所述的泛一、二甲基化抗体的制备方法，其特征在于具体操作流程如下: (一)制备把半胱氨酸模拟成一甲基化修饰赖氨酸(Kc[me I ])的载体蛋白 (1)取10-50mg载体蛋白溶解到烷基化试剂中，该试剂主要成分为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、盐酸胍、L-甲硫氨酸； (2)加入1-1Omg二硫苏糖醇，进行反应； (3)加入与载体蛋白等量的(2-氯乙基)-甲基氯化铵，进行烷基化反应； (4)加入1-1Omg二硫苏糖醇，继续反应； (5)加入20-200ul巯基乙醇终止反应，得到模拟一甲基化修饰的载体蛋白，记为Kc[mel]； (二)制备把半胱氨酸模拟成二甲基化修饰赖氨酸(Kc[me2 ])的载体蛋白 (1)取10-50mg载体蛋白溶解到烷基化试剂中，该试剂主要成分为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、盐酸胍和L-甲硫氨酸； (2)加入1-1Omg二硫苏糖醇，进行反应； (3)加入与载体蛋白等量的(2-氯乙基)-二甲基氯化铵，进行烷基化反应； (4)加入1-1Omg二硫苏糖醇，继续反应； (5)加入与载体蛋白等量的(2-氯乙基)-二甲基氯化铵，继续烷基化反应； (6)加入20-200ul巯基乙醇终止反应，得到模拟二甲基化修饰的载体蛋白，记为Kc[me2]； (三)混合载体蛋白(Kc[mel])和载体蛋白(Kc[me2])，混合物免疫兔子，得到血清抗体，即泛一、二甲基化抗体。3.由根据权利要求1或2所述制备方法得到的泛一、二甲基化抗体。
【专利摘要】本发明属于生物医药技术领域，具体为一种泛一二甲基化抗体及其制备方法。本发明直接用多肽偶联载体蛋白，如牛血清白蛋白或卵清蛋白或血蓝蛋白或牛甲状腺球蛋白作为免疫抗原前提底物，用烷基化试剂(2-氯乙基)-甲基氯化铵和(2-氯乙基)-二甲基氯化铵通过化学修饰把载体蛋白中的半胱氨酸进行烷基化修饰分别模拟成一甲基化修饰赖氨酸(Kc[me1])和二甲基化修饰赖氨酸(Kc[me2])；再以Kc[me1]和Kc[me2]的混合物作为免疫抗原，免疫兔子，得到特异性识别一二甲基化蛋白抗体。用泛一二甲基化抗体与多个组蛋白甲基化修饰的多肽进行免疫沉淀实验并进行蛋白质印迹检测，结果显示，得到的泛一二甲基化抗体可以特异识别一二甲基化修饰的组蛋白多肽而几乎不识别零甲基化，或者三甲基化修饰的组蛋白多肽。
【IPC分类】C07K16/06
【公开号】CN105713086
【申请号】CN201610166902
【发明人】蓝斐, 沈宏杰, 徐文绮
【申请人】复旦大学