鹅oaz1多肽抗原及其多克隆抗体制备方法和应用
【专利摘要】一种鹅OAZ1多肽抗原及其多克隆抗体的制备方法和应用，本发明在鹅OAZ1序列基础上，鉴定了鹅OAZ1基因的+1移码位点，并在+1移码位点后筛选、鉴定了一段特异性多肽序列。发明方法包括：①OAZ1序列分析及多肽抗原序列的筛选和鉴定。②OAZ1多肽抗原序列N端修饰、合成及检测。③将OAZ1多肽抗原免疫新西兰兔制备抗血清并检测其效价；④OAZ1抗体的纯化。本发明所制备的OAZ1多肽抗体可特异性结合鹅组织中OAZ1全长功能蛋白质，填补了鹅OAZ1蛋白质检测研究领域的空白，为鹅OAZ1功能以及多胺调控动物繁殖功能的研究奠定基础。
【专利说明】
鹅0AZ1多肽抗原及其多克隆抗体制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学及分子免疫学领域，涉及一种鹅0AZ1多肽抗原及其多克隆抗 体制备方法和应用，所制备的抗体具有制备方法简单、快速，成本低，效价高，能特异性结合 鹅组织中0ΑΖ1蛋白质的特点。
【背景技术】
[0002] 多胺(包括腐胺、亚精胺和精胺)是一类带有两个或两个以上氨基的低分子脂肪族 化合物，可参与调控基因表达和翻译、细胞增殖、细胞信号转导、细胞膜稳定等过程。多胺水 平过低可导致细胞生长受到抑制甚至死亡，但是当多胺水平异常升高时也会导致癌症的发 生，因此细胞多胺稳态的维持对于细胞正常生长具有重要意义。
[0003] 鸟氨酸脱駿酶抗酶 1 (ornithine decarboxylase antizyme 1 ,ΟΑΖΙ)是多胺代谢 过程中的关键调控酶。0ΑΖ1能与多胺生物合成过程中第一限速酶鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase，0DC)结合并革巴向促使其被26S蛋白酶降解，进而负反馈调控细胞内多胺水 平。近年来研究表明，0AZ1具有抗肿瘤效应和调控动物繁殖的功能。
[0004] 0ΑΖ是由0ΑΖ基因通过特殊的+ 1移码机制编码的蛋白质。目前已经发现的0ΑΖ基因 家族成员包括0AZ1、0AZ2、0AZ3和0AZ4,其中0AZ1分布最为广泛，是调控0DC功能的重要成 员。四川白鹅0AZ1基因的cDNA序列包含652bp的完整编码区序列，其0RF1 (由58个氨基酸组 成）与0RF2(由158个氨基酸组成）间的+ 1移码位点位于第1个起始密码子ATG后的+ 1751?^ 基。0AZ1主要通过泛素化途径被26S蛋白酶体降解，而多胺可通过诱导OAZlmRNA翻译中的+1 移码机制来抑制这个泛素化降解过程，上调0AZ1表达，从而使0DC降解，抑制多胺的生物合 成过程。近年来的研究表明，0AZ1可以通过调节卵泡的生长发育及排卵过程参与调控动物 繁殖功能。我们前期研究发现，0AZ1在产蛋期籽鹅卵巢组织中表达量显著高于产蛋前期，提 示0AZ1可能通过调控卵巢组织中多胺水平，进而参与调控籽鹅的繁殖功能。随后我们应用 干扰和过表达技术研究并证实，0AZ1在鹅卵巢卵泡颗粒细胞增殖、凋亡，类固醇激素生成以 及生殖激素受体表达过程中具有重要调控作用。但是，目前缺乏商品化的家禽0AZ1抗体，而 且0AZ1单克隆抗体制备过程复杂，耗时长，耗资大，使得0AZ1功能研究仅停留在基因水平， 严重阻碍了 0AZ1以及多胺调控动物繁殖功能的研究。
【发明内容】
[0005] 为解决上述现有技术存在的问题，弥补现有家禽0AZ1全长功能蛋白质研究的空 白，本发明公开了一种鹅0AZ1多肽抗原及其多克隆抗体制备方法和应用，该多肽抗原和多 克隆抗体，具有制备方法简单、快速，成本低，效价高的特点，并可特异性结合鹅组织中0AZ1 蛋白质。
[0006] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0007] 一种鹅0AZ1全长功能蛋白质多肽抗原，0AZ1多肽抗原的氨基酸位点位于其+1移码 位点之后，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种抗鹅0AZ1多肽抗体的制备方法，合成SEQ ID NO. 1所示多肽序列，在其N端增 加一个半胱氨酸得到N端修饰肽得到SEQ ID N0.2所示序列，并进行质谱MS和高效液相色谱 HPLC检测，将N端修饰肽与血蓝蛋白交联得到交联多肽，用该交联多肽免疫新西兰兔后，颈 总动脉放血收集新西兰兔血液，3000rpm离心10min后收集血清，然后应用亲和柱层析的方 法纯化血清中的0AZ1多克隆抗体。
[0009] 利用上述方法所制的抗鹅0AZ1多肽抗体。
[0010] 该抗体效价在1:512000以上。
[0011] 所述抗体在检测鹳组织0AZ1蛋白质水平方面的应用。
[0012] 所述抗体在检测鹅0AZ1功能以及多胺调控动物繁殖功能方面的应用。
[0013] 所述抗体在鹅下丘脑和卵巢组织中0AZ1全长功能蛋白质检测方面的应用。
[0014] 相对于现有技术，本发明的有益效果为:①本发明在前期所获得的鹅0AZ1基因序 列基础上，对该序列进行亲水性、抗原性、表面可及性和同源性分析，选择综合评分最高的 肽段作为靶序列进行人工合成，由于所选择的多肽序列位于鹅0AZ1基因+ 1移码位点之后， 因此可用于检测鹅0AZ1全长功能蛋白质。②合成上述序列后进行N端修饰并与血蓝蛋白交 联，应用MS和HPLC检测上述交联蛋白。③将所制备的多肽复合物免疫新西兰兔，利用间接 ELISA方法检测抗血清效价，所制备的抗血清效价在1:512000以上。④应用亲和柱层析的方 法纯化血清中的0AZ1多克隆抗体。本发明所制备的0AZ1多肽抗体可特异性结合鹅组织中 0AZ1全长功能蛋白质，填补了鹅0AZ1蛋白质检测研究领域的空白，为鹅0AZ1功能以及多胺 调控动物繁殖功能的研究奠定基础。
【附图说明】
[0015] 图1为HPLC检测N端修饰肽纯度的结果图。本发明制得的兔抗鹅0ΑΖ1多肽多克隆抗 体纯度为92.15%。
[0016] 图2为电喷雾电离质谱检测N端修饰肽相对分子量的结果图。本发明制得修饰肽实 际分子量为1641.40Da，与理论值（1641.95Da) -致。
[0017]图3为应用本发明0AZ1多克隆抗体检测鹅卵巢和下丘脑0AZ1蛋白质表达量的免疫 印迹结果图。其检测结果条带清晰，特异性好。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明方案做进一步详细描述：
[0019] 本发明对前期获得的鹅0AZ1序列进行分析后，设计并合成鹅0AZ1多肽抗原，在其N 端增加一个半胱氨酸得到N端修饰肽并进行MS和HPLC检测，将N端修饰肽与血蓝蛋白交联并 免疫新西兰兔，收集血液制备抗血清，并进行间接ELISA检测，采用亲和柱层析方法纯化抗 体。经免疫印迹鉴定表明，该多克隆抗体可特异性结合鹅组织中0ΑΖ1蛋白质，为鹅0ΑΖ1和多 胺调控动物繁殖功能的研究奠定基础。
[0020] 具体步骤如下：
[0021] 步骤一:鹅0AZ1序列分析、多肽位点选择以及合成
[0022]利用生物信息学相关软件，对鹅0AZ1基因进行分析，结果发现:鹅0AZ1基因的cDNA 序列包含652bp的完整编码区序列，其0RF1 (由58个氨基酸组成）与0RF2(由158个氨基酸组 成)间的+1移码位点位于第1个起始密码子ATG后的第175位碱基。
[0023] 经DNAstar软件对鹳0AZ1氨基酸序列进行亲水性（Hydrophi 1 icity)、抗原性 (Antigenicity)、表面可及性(Surface probability)和同源性(Homology)分析，选择综合 评分最高的肽段，亦即鹅0AZ1蛋白N端V188-A201，作为拟合成的多肽靶序列，其氨基酸序列 为VRPGHPLVPKRH)A，如SEQ ID NO. 1所示。为进行N末端修饰，所以在N端添加一个半胱氨酸 残基，故最终合成多肽序列为CVRPGHPLVPKRPDA，SEQIDN0.2所示，其理论分子质量为 1641.95Da。
[0024] 步骤二:鹅0AZ1多肽鉴定
[0025] 应用HPLC，C184·6X250mmAlltimaTM分离柱，并用0·065%三氯乙酸的水溶液和 0.05%三氯乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，于220nm检测N末端修饰肽段的纯度。结果表明， 本发明设计并合成的鹅0AZ1的N末端修饰肽段纯度约为92.15% (图1)。图1的峰面积结果汇 总表如表1所不：
[0026] 表1峰面积结果汇总表
[0027]
L〇〇28」米用电喷雾电离质谱万法测定本友明设计并合成的鹅0AZ1的N末端修饰肽段的分 子量。结果表明，本发明设计并合成的鹳0AZ1的N末端修饰肽段实际分子量为1641.40Da，与 理论值（1641.95Da)-致（图 2)。
[0029]步骤三:?〇ΑΖ1的N末端修饰肽段与血蓝蛋白交联
[0030] 由于血蓝蛋白的抗原性比牛血清白蛋白和鸡卵白蛋白的抗原性强，血蓝蛋白、牛 血清白蛋白和鸡卵白蛋白均可刺激辅助性Τ细胞并进一步诱导Β细胞免疫反应，因而本发明 选择血蓝蛋白作为交联蛋白，采用MBS作为交联剂将血蓝蛋白和鹅0ΑΖ1的Ν末端修饰肽进行 交联。其操作方法是，将5mg的血蓝蛋白和5mg鹳0AZ1的N末端修饰肽在25°C条件下交联3h， 并将上述反应液用磷酸盐缓冲液透析过夜，然后收集并获得血蓝蛋白-0AZ1的N末端修饰肽 段的交联蛋白。
[0031] 步骤四：抗血清制备及纯化
[0032] 用磷酸盐缓冲液稀释lOOyg步骤三获得的交联蛋白至500yL，加入等体积的完全弗 氏佐剂混匀，漩涡震荡60min后检测乳化效果，取1滴抗原滴于去离子水中，lmin不溶解扩散 则表明乳化完全，可用于后续的实验操作。
[0033]从新西兰兔耳缘静脉采集血液并分离血清，_80°C保存作为阴性对照血清。新西兰 兔经适应性饲养后，将经完全弗氏佐剂处理的血蓝蛋白-0AZ1的N末端修饰肽段的交联蛋白 皮下注射给新西兰兔体内，15天进行加强免疫，然后采集家兔血液，3000rpm离心10min后收 集血清。
[0034]步骤五:抗血清效价检测
[0035]用4yg/mL浓度0ΑΖ1的N端修饰肽在4 °C条件下包被间接EL ISA板12h。然后，在室温 条件下，用山羊血清封闭，再用磷酸盐缓冲液洗涤以去除未包被的抗原。将由步骤四制备的 抗体按比例为 1:1〇〇〇、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1: 256000、1:512000进行稀释。按照每孔100yL的剂量加入检测板，同时设立阴性对照和空白 对照，然后每孔再加入200yL的磷酸盐缓冲液洗涤2次，再加入1:1000稀释的辣根过氧化物 酶标记的山羊抗兔二抗l〇〇yL，37 °C孵育45min，每孔加入200yL的磷酸盐缓冲液洗涤2次，每 孔中加入l〇〇yL的TBE显色液，37 °C孵育15min后，测定450nm的吸光值，与阴性血清的比值大 于2.1判定为阳性，计算抗体效价。本实验得出的抗体效价为1:512000以上(表2)。
[0036] 步骤六:抗体纯化
[0037]采用亲和柱层析的方法纯化抗体，
[0038]将lmL活化的凝胶悬液注入层析柱，然后加入5mL的偶联缓冲液冲洗2次。迅速与溶 于5mL偶联缓冲液的500yg鹅0AZ1的N端修饰肽进行混合，室温条件下旋转混合过夜。用偶联 缓冲液和甘氨酸缓冲液交替洗涤2次，最后用1 X磷酸盐缓冲液清洗凝胶，制备好的凝胶保 存在1 X磷酸盐缓冲液中，并加入终浓度为0.02 %的叠氮钠，4 °C保存。将步骤四获得的抗血 清与50mM，pH为7.4的磷酸盐缓冲液等体积混合后，加入含有N端修饰肽的层析柱中，室温混 匀后，再用4mL偶联缓冲液洗涤层析柱。用15mL的洗脱缓冲液洗脱层析柱获得纯化的0AZ1抗 体。
[0039] 步骤七:鹅组织0AZ1蛋白质的免疫印迹检测
[0040] 采用RIPA裂解液提取鹅下丘脑和卵巢组织蛋白。按照标准方法配制SDS-PAGE凝 胶，取16yL的组织蛋白裂解液，并加入蛋白上样缓冲液5yL，95°C高温变形10min后置于冰 上，将变性后的蛋白质产物全部加入到胶孔中，先用60V恒压电泳跑浓缩胶，当指示剂溴酚 蓝进入分离胶后改用90V恒压电泳进行分离，当指示剂达到距凝胶下端约0.5cm处时终止电 泳。在半干转膜仪上采用电转膜法将分离的蛋白产物转至PVDF膜，25V恒压转膜10min，用封 闭液室温摇床封闭3h后回收封闭液，将步骤六获得的0AZ1抗体作为一抗，用稀释液稀释到 1:300后加入杂交袋中，将膜转移到杂交袋，4 °C孵育过夜。TBST洗膜3次后转移到另一个杂 交袋中，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育2h后，将膜用TBST和TBS洗涤后，ECL 显色反应后得到免疫印迹结果（图3)。
[0041 ]本发明①利用DNAstar软件对鹳0AZ1氨基酸进行亲水性、抗原性等分析并选择综 合评分最高的肽段作为拟合成的多肽靶标，然后人工合成该肽段。②鹅0AZ1翻译具有特殊 的+1移码机制，当0AZ1只表达0RF1时候，最终获得的是无抗酶活性的多肽链，只有同时翻译 两个0RF才能得到0AZ1全长功能蛋白，因而我们选择位于0RF2的一段多肽序列，其目的就是 为了检测具有全长功能鹅0AZ1蛋白。
[0042]实验结果
[0043]图1和2分别为多肽纯度和相对分子量的检测结果:兔抗鹅0AZ1的N端修饰肽纯度 约为92.15% ;质谱检测结果显示鹅0AZ1的N末端修饰肽实际分子量为1641.40Da，与理论值 (1641.95)-致。
[0044] 抗血清效价:新西兰兔抗血清效价在1:512000以上(表2)。
[0045]表2兔抗鹅0AZ1多克隆抗血清的效价
[0046]
[0047] 表2为间接ELI SA检测兔抗鹅OAZ1多克隆抗血清的效价结果。采用间接ELI SA法检 测发现所制得的兔抗鹅0ΑΖ1多克隆抗体效价在1:512000以上。
[0048]免疫印迹:免疫印迹实验结果显示条带清晰，特异性好，提示本发明制备的抗体能 特异性结合鹅组织中0AZ1蛋白质，可用于检测鹅下丘脑和卵巢组织中0AZ1蛋白质表达水平 (图3)。下丘脑中0AZ1全长功能蛋白质的表达量显著高于卵巢组织，这与我们所报道的下丘 脑中0AZ1基因 mRNA表达量显著高于卵巢组织的结果相一致。
【主权项】
1. 一种鹅0AZ1多肽抗原，其特征在于:0AZ1多肽抗原的氨基酸位点位于其+1移码位点 之后，其序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -种抗鹅0AZ1多肽抗体的制备方法，其特征在于，合成SEQ ID NO. 1所示多肽序列， 在其N端增加一个半胱氨酸得到N端修饰肽得到SEQ ID NO. 2所示序列，并进行质谱和高效 液相色谱检测，将N端修饰肽与血蓝蛋白交联得到交联多肽，用该交联多肽免疫新西兰兔 后，颈总动脉放血收集新西兰兔血液，3000rpm离心10min后收集血清，然后应用亲和柱层析 的方法纯化血清中的0AZ1多克隆抗体。3. 利用权利要求2方法所制的抗鹅0AZ1多肽抗体。4. 根据权利要求3所述的抗体，其特征在于:该抗体效价在1:512000以上。5. 权利要求3所述抗体在检测鹅组织0AZ1蛋白质水平方面的应用。6. 权利要求3所述抗体在检测鹅0AZ1功能以及多胺调控动物繁殖功能方面的应用。7. 权利要求3所述抗体在鹅下丘脑和卵巢组织中0AZ1全长功能蛋白质检测方面的应 用。
【文档编号】C07K16/06GK106008690SQ201610325381
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】康波, 姜冬梅, 徐麒麟, 马容, 何珲, 陈咨余, 易治鑫, 龙诗韵
【申请人】四川农业大学