人Aβ42抗原决定簇多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及人Aβ42抗原决定簇多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒。本发明的Aβ42抗原决定簇多肽，为序列表SEQ?ID?NO.1所述的多肽片段。本发明的Aβ42抗原由Aβ42抗原决定簇多肽制得。本发明的Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体由本发明的Aβ42抗原制得。本发明的Aβ42单克隆抗体或多克隆抗体用于制备Aβ42体外诊断试剂盒。本发明的Aβ42抗原用于制备Aβ42抗体体外诊断试剂盒。本发明的人Aβ42抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
【专利说明】人Αβ 42抗原决定族多肽、抗原、抗体、用途及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于多肽化学领域，具体涉及人Αβ 42抗原决定簇多肽、用该多肽制备的Αβ 42特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗原和抗体分别在制备人A β 42体外诊断试剂盒和人A β 42抗体体外诊断试剂盒上的用途，以及人A β 42体外诊断试剂盒和人A β 42抗体体外诊断试剂盒。
【背景技术】
[0002]目前，我国已经进入老龄化社会，而阿尔茨海默病(AD)是老年人的常见病和多发病，又称老年性痴呆，60岁以上老人的发病率> 5%。AD是一种中枢神经系统原发性退行性疾病，患者进行性智力和认知功能降低。神经退行性疾病是由于神经元进行性变性、死亡导致的、以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，严重危害人类身体健康，但其病因不清，发病机理复杂，缺乏有效的治疗措施。除人们熟知的老年性痴呆(Alzheimer disease, AD)、帕金森氏病(Parkinson’ s disease,PD)等以外，在人群中发病率日趋增高、且发病年龄日趋下降的糖尿病晚期并发症均以神经退行性病变为首发因素。由于神经退行性疾病缺乏有效的早期诊断措施，给治疗、护理带来了一系列实实在在的问题，同时给社会和家庭造成了沉重的经济负担和精神压力。例如老年性痴呆(AD，也称阿尔茨海默病)，预计到2050年我国老年性痴呆患者将达到2000万人。如果政府和家庭对每一位AD病人花费的医疗费、护理费和家庭成员的误工费等平均每年I万元，那么到2050年我国对老年痴呆患者每年将付出2000亿元的费用。如此之重的经济负担将严重阻碍我国的经济发展，并可能引发社会问题。故研究神经退行性变发病机理和延缓、阻断其发展的干预手段，有着至关重要的意义。
[0003]作为引起老年痴呆 最常见的病因，阿尔茨海默病临床上表现为智力水平的慢性削弱及记忆的慢性丢失。随着全球人口的老龄化，AD发病率也与日俱增，因此，AD的及时诊断与治疗必将越来越受到重视。
[0004]老年性痴呆的主要神经病理学特征是神经元细胞内出现神经元纤维缠绕结，神经细胞外有神经变性斑(老年斑)。目前认为构成老年斑的主要成分为β淀粉样蛋白(amyloid beta-protein, A β ),是 β 淀粉样前体蛋白(β-amyloid Precursor protein,APP)的代谢产物，Αβ有两种形式，分别是由40个氨基酸和42个氨基酸组成的多肽片段，前者称为Αβ 40,正常老年人和AD患者脑内均有；后者称为Αβ 42,主要见于AD患者脑内。近年大量研究表明Αβ42的增加与AD发病密切相关，它主要引起脑组织形成可溶性的A β 42寡聚体及不溶性的A β沉积，即AD特有的病理改变，且A β 42在CSF (脑脊液)和血液中都能检出，是AD重要的标志物。在AD病人患病晚期，血液中A β 42浓度增高，消耗了A β 42抗体导致A β 42抗体含量低于健康老年人，因此，如果在AD发病前和发病过程中的不同阶段对血液中Αβ 42及Αβ 42抗体进行追踪检测，一方面可用于诊断已出现症状的病人并对病情程度进行跟踪；另一方面，也是更重要的，用于诊断尚未出现明显症状的老人，在发病之前进行预防性医治，延缓发病时间。如能顺利研制出Αβ 42及Αβ 42抗体检测试剂盒，将对AD预测、早期发现及预防、病程发展和疗效观察具有重要意义。[0005]而监测A β 42及其抗体最理想的方法即是免疫测定，因此寻找合适的具有免疫原性的A β 42肽段，制备特异性的A β 42抗原及抗体就成了重点。
【发明内容】
[0006]为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种人Αβ 42抗原决定簇多肽，用该多肽制备的A β 42特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体，以及人A β 42体外诊断试剂盒和人A β 42抗体体外诊断试剂盒。
[0007]具体而言，本发明提供了:
[0008](I) 一种人A β 42抗原决定簇多肽，其氨基酸序列为:
[0009]Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-1le-Ala。 [0010](2) 一种A β 42抗原，其包含⑴所述的人A β 42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。
[0011 ] (3) 一种人A β 42单克隆抗体或多克降抗体，其由(2)所述的人A β 42抗原制备而成。
[0012](4)根据(3)所述的人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体在制备人A β 42体外诊断试剂盒上的用途。
[0013](5) 一种人A β 42体外诊断试剂盒，其包含(3)所述的人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体。
[0014](6)根据(5)所述的试剂盒，其中所述试剂盒采用所述人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体。
[0015](7)根据(5)所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含人A β 1-28多克隆抗体作为结合抗体。
[0016](8)根据⑵所述的A β 42抗原在制备人A β 42抗体体外诊断试剂盒上的用途。
[0017](9) 一种人Aβ 42抗体体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒采用(2)所述的人Αβ 42抗原作为包被抗原。
[0018](10)根据(9)所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。
[0019]本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果:
[0020]1.本发明的人Αβ42抗原决定簇多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。
[0021]2.用本发明的人Αβ 42抗原决定簇多肽制备的抗原能够高度特异地与血液样本中的Aβ 42抗体结合，并且本发明制备的Aβ 42单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的Aβ 42结合。
[0022]3.本发明的人A β 42体外诊断试剂盒和人A β 42抗体体外诊断试剂盒能够对AD进行预测、早期发现及预防，并且能够对病程发展进行监控，因此对为AD的早期临床诊断提供依据、为病人得到及时治疗作出了重要贡献。
【具体实施方式】
[0023]以下通过【具体实施方式】的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0024]本文中所述的人A β 42蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，例如在参考文献:“ β -淀粉样肽的结构、合成与性质及其与老年痴呆症的关系，刘勉，叶蕴华，化学通报，2002年，第7期458-462”中披露了该氨基酸序列。
[0025]本发明提供了一种人Αβ 42抗原决定簇多肽，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示，为:
[0026]Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-1le-Ala。 [0027]本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，发现以人Αβ 42蛋白C末端的8个氨基酸残基作为抗原决定簇，在其N端添加亲水性肽段Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp,并在所得肽段的N端加Tyr，能够使最终所得多肽具有亲水性、抗原性强并且易于合成。
[0028]目前，本发明研究发现，本发明的肽段具有如下功能:
[0029]1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；
3.用这种肽段制备的抗体可特异性的与人A β 42结合，并且与类似物A β 40无明显交叉反应。
[0030]本发明的Αβ 42抗原决定簇多肽的制备方法可用化学合成法:利用美国ΑΒΙ431Α型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇肽段。本发明的多肽的分子量为1675.15，可利用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。肽段的纯度用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原肽段的浓度。
[0031]本发明还提供了一种Αβ 42抗原，其包含本发明的人Αβ 42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。该A β 42抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的A β 42抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH (钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。
[0032]本发明还提供了一种人A β 42单克隆抗体和人A β 42多克隆抗体，该抗体可以利用本发明的Αβ42抗原(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。
[0033]本发明的Αβ 42单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人Aβ 42体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于ELISA法对人体组织、细胞或体液中的Αβ 42蛋白进行检测，优选对血液样本中的Aβ 42蛋白进行检测。
[0034]因此，本发明提供了一种人A β 42体外诊断试剂盒，其包含本发明的人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体。
[0035]目前已知用于临床检验的ELISA主要包括以下几种类型:双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。
[0036]本发明的人A β 42体外诊断试剂盒优选采用双抗体夹心法来检测A β 42蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。
[0037]优选的是，所述人A β 42体外诊断试剂盒采用本发明的人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体，在本文中，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体；此外，所述人A β 42体外诊断试剂盒还优选包含人A β卜28多克隆抗体以作为结合抗体，在本文中，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体；并且还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为羊抗鼠IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。术语“人Αβ42n”是指人Αβ42Ν端的1-28位氨基酸序列。
[0038]用本发明的人Αβ 42体外诊断试剂盒进行临床研究，对115例不同类别的血样标本进行检测。结果为，47例健康对照组的血浆A β 42蛋白浓度值为95.1 + 7.2pg/ml ;在35例轻度AD患者[19≤简易智力状态检查表(MMSE)值≤26分，临床痴呆程度量表(OTR)值=I分]中，血浆A β 42浓度值为146.4 ±9.7pg/ml ;中晚期AD患者(MMSE < 19分，CDR≥2分)血浆标本中的Aβ 42浓度为99.4±17.6pg/ml。由此可知，轻度AD患者血浆标本中的Αβ42中值明显高于健康对照组及中度及以上患者，而健康对照组与中晚期AD患者血浆标本中的Αβ 42值无明显差异。这说明Αβ 42浓度在AD早期会明显增大，而随着病情的加重，A β 42与产生的A β 42抗体结合，不再呈游离可测状态，故测到的A β 42又会减少，表现出Αβ 42浓度下降。
[0039]本发明的Aβ 42抗原可以用于制备Aβ 42抗体体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于ELISA法对人体组织、细胞或体液中的A β 42抗体进行检测，优选对血液样本中的A β 42抗体进行检测。
[0040]因此，本发明提供了一种人Αβ 42抗体体外诊断试剂盒，该试剂盒优选采用间接法来检测Αβ 42抗体。该试剂盒可以包含包被抗原、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。
[0041]优选的是，本发明的人Αβ 42抗体体外诊断试剂盒采用本发明的人Αβ 42抗原作为包被抗原。在本文中，术语“包被抗原”是指包被于固相的酶标板上的抗原。
[0042]优选的是，所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为抗人IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。
[0043]用本发明的人Αβ 42抗体体外诊断试剂盒进行临床研究，对115例不同类别的血样标本进行检测。结果为，47例健康对照组的血浆A β 42抗体浓度值为169.32 ±62.97 μ g/ml ;在35例轻度AD患者[19 <简易智力状态检查表(MMSE)值≤ 26分，临床痴呆程度量表(OTR)值=I分]中，有30例的血浆A β 42抗体浓度超过190.42 μ g/ml，35例患者的平均水平为200.44±58.78 μ g/ml ;而中晚期AD患者(MMSE < 19分，CDR≥2分)血浆标本中的Αβ 42抗体浓度下降，平均水平为90.4±23.6 μ g/ml。由此可知，轻度AD患者血液中的A β 42抗体浓度较健康组略有升高，而中晚期AD患者血浆标本中的A β 42抗体浓度与健康对照组和轻度AD患者有明显差异。这说明A β 42抗体在AD早期稍有升高，但随着病情的加重，A β 42抗体与A β 42结合，表现出A β 42抗体浓度显著下降。
[0044]基于此发现，利用本发明的Aβ 42单克隆抗体或多克隆抗体制备的人Aβ 42体外诊断试剂盒，以及利用本发明的Αβ 42抗原决定簇多肽或Aβ 42抗原制备的人Aβ 42抗体体外诊断试剂盒能够对AD进行预测、早期发现及预防，并且能够对病程发展进行监控。
[0045]在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。
[0046]以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
[0047]实施例
[0048]除非另有说明，以下所述溶液均为水溶液，溶液中的百分数均为体积百分数。
[0049]实施例1:Α β 42抗原决定簇多肽片段的制备。
[0050]制备方法用化学合成法:利用美国ΑΒΙ431Α型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原决定簇肽段。多肽的纯度用高效液相色谱进行评定，并测定抗原肽段的浓度。本发明的多肽的分子量为1675.15，利用质谱进行确定，通过多肽序列测定鉴定所合成的多肽序列。
[0051]一、A β 42抗原决定簇肽段的合成
[0052]该肽段采用固相法合成。固相肽合成的主要思想是:先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链。这样的步骤可以反复地多次进行下去，最后达到所需要合成的肽链的长度。这个合成过程如下所示。
[0053]
【权利要求】
1.一种人A β 42抗原决定簇多肽，其氨基酸序列为:
Tyr-Arg-Asp-Gly-Asp-Gly-Asp-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-1le-Alaο
2.—种A β 42抗原，其包含权利要求1所述的人A β 42抗原决定簇多肽以及与该多肽相连的载体蛋白。
3.—种人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体，其由权利要求2所述的人A β 42抗原制备--? 。
4.根据权利要求3所述的人Aβ 42单克隆抗体或多克隆抗体在制备人A β 42体外诊断试剂盒上的用途。
5.一种人A β 42体外诊断试剂盒，其包含权利要求3所述的人A β 42单克隆抗体或多克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒采用所述人Aβ 42单克隆抗体或多克隆抗体作为包被抗体。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含人Aβ 1-28多克隆抗体作为结合抗体。
8.根据权利要求2所述的Aβ 42抗原在制备人A β 42抗体体外诊断试剂盒上的用途。
9.一种人Αβ42抗体体外诊断试剂盒，其中所述试剂盒采用权利要求2所述的人Αβ 42抗原作为包被抗原。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含酶标记的第二抗体。
【文档编号】G01N33/68GK103665113SQ201210345681
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月14日 优先权日:2012年9月14日
【发明者】盛树力, 朱建安 申请人:深圳市安群生物工程有限公司