LppZ抗体识别的抗原多肽及其用图

LppZ抗体识别的抗原多肽及其用图
【专利摘要】本发明公开了LppZ抗体识别的抗原多肽及其用途，其中该抗原多肽的多肽活性片段为下列至少之一：1)SEQ ID NO:1所示序列：SGCARFNDAQSQPFT；2)SEQ ID NO:2所示序列：EPDVVRKDTHAHAWA；3)SEQ ID NO:3所示序列：HAHAWALRMSPDGNV；4)选自SEQ ID NO:1?3所示氨基酸序列的至少两种的连接产物；5)1)?4)所述的多肽活性片段经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨基酸衍生序列。利用本发明的LppZ抗体识别的抗原多肽，能够有效地检测样品，例如结核病或疑似结核病患者的血液样品(例如血清样品)中的LppZ抗体水平。
【专利说明】
LppZ抗体识别的抗原多肽及其用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及LppZ抗体识别的抗原多肽及其用 途。更具体地，本发明涉及人血清抗体与LppZ蛋白的结合位点，LppZ抗体识别的抗原多肽、 该抗原多肽在制备检测血清中LppZ抗体水平的试剂盒中的用途、用于检测样品中LppZ抗体 水平的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结核病是全球三大传染性疾病之一，世界卫生组织(WT0)发布的流行病调查报告 显示，我国结核病分支杆菌感染病理占全球总病例数的12%，仅次于印度，位居全球第二。 结核病的高发和流行严重影响了我国的社会和经济发展。目前临床上使用的结核病诊断方 法主要以结核菌的检出作为金标准，如痰涂片、痰集菌和痰培养的方法，其诊断方法耗时 长，特异性或者敏感性低。
[0003] 基于血清免疫学的检测方法是现阶段结核病诊断的重要辅助手段之一，其中广泛 使用的抗原特异性r 一干扰素释放实验（IGRA)有商业试剂盒T-spot. TB和QFT-IT。
[0004] IGRA使用的抗原是结核分支杆菌RD(region of difference)区基因编码的全蛋 白，生产成本高，价格昂贵，世界卫生组织不推荐中低收入国家作为筛查检测手段广泛使 用。并且也有研究表明，在结核病高度流行的国家，IGRA的诊断受到环境因素干扰特异性降 低，假阳性升高，不适用于我国国情，需要寻找更好的血清免疫学诊断标志物。
[0005] 因而，目前的结核病血清免疫学诊断、检测方面的研究仍有待加强。

【发明内容】

[0006] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0007] 结核分枝杆菌膜表面脂质体蛋白LppZ能引起人体免疫反应，产生相应抗体，血清 抗LppZ多克隆抗体的表达水平能反映出个体的结核分枝杆菌感染状态。目前利用ELISA等 免疫印迹杂交技术检测血清抗LppZ抗体的方法均需要LppZ纯蛋白作为识别抗原。LppZ属于 糖蛋白，其序列上有多个糖基化位点，使得体外表达的LppZ蛋白稳定性较差，且难以复性至 天然构象，影响检测结果的稳定性。此外，纯化蛋白制备过程繁琐，费时耗力，成本较高。
[0008] 本发明旨在解决现有技术的上述缺陷至少之一，而提供一种有用的商业选择。
[0009] 从而，本发明利用多肽微阵列的技术筛选获得了 LppZ蛋白抗原识别高频表位，并 提供了包含血清抗体识别LppZ蛋白的核心氨基酸序列和保护氨基酸序列并偶联载体蛋白 如KLH等的LPPZ抗体识别的抗原多肽，基于结核病患者血清LppZ抗体表达水平较健康人显 著升高，利用这些抗原多肽通过免疫印迹检测手段可有效检测待测者血清中的LppZ抗体水 平，进而能够用于结核病诊断。
[0010]为此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种LppZ抗体识别的抗原多肽。根据本 发明的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一：
[0011] 1)SEQ ID N0:1 所示序列：SGCARFNDAQSQPFT;
[0012] 2)SEQ ID从)：2所示序列4?0"服01'撤撤歡；
[0013] 3)SEQ ID 从)：3所示序列：撤撤歡0?0306·;
[0014] 4)选自SEQ ID NO: 1-3所示氨基酸序列的至少两种的连接产物；
[0015] 5)1)-4)所述的多肽活性片段经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨 基酸衍生序列。
[0016] 发明人惊奇地发现，利用本发明的上述LppZ抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹 检测手段可有效检测待测者血清中的LppZ抗体水平，进而基于待测者血清LppZ抗体表达水 平是否较健康人显著升高，能够有效进行结核病诊断，确定待测者是否为疑似结核病患者。 其中，结核病患者血清LppZ抗体表达水平较健康人显著升高。并且，根据本发明的实施例， 本发明的上述抗原多肽LppZ抗体识别特异性好，LppZ抗体水平检测效率高，且制备简单，成 本低，易于进行工业化生产，利于大量推广应用。
[0017] 进一步，基于利用上述LppZ抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹检测手段可有效 检测待测者血清中的LppZ抗体水平，在本发明的第二方面，本发明提供了前面所述的LppZ 抗体识别的抗原多肽在制备检测血清中LppZ抗体水平的试剂盒中的用途。
[0018] 根据本发明的实施例，该试剂盒用于结核病诊断。其中，基于结核病患者血清LppZ 抗体表达水平较健康人显著升高，能够有效对待测者进行结核病诊断。
[0019] 在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于检测样品中LppZ抗体水平的试剂 盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的LppZ抗体识别的抗原多肽。根据本发 明的实施例，利用该试剂盒能够有效检测样品中LppZ抗体水平，进而基于结核病患者血清 LppZ抗体表达水平较健康人显著升高，能够有效对待测者进行结核病诊断。
[0020] 具体地，根据本发明的实施例，所述LppZ抗体识别的抗原多肽以下列的至少一种 形式提供：
[0021] 1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述LppZ抗体识别的抗原多肽；
[0022] 2)微球，所述微球偶联所述LppZ抗体识别的抗原多肽。
[0023]进一步，根据本发明的一些具体示例，该试剂盒进一步包括：阳性对照样品，所述 阳性对照样品为抗LppZ蛋白的抗体。由此，利用该试剂盒进行LppZ抗体水平检测和结核病 诊断时，结果更加可靠。
[0024]根据本发明的实施例，进一步包括:标准样品，所述标准样品为多例LppZ抗体表达 为阳性的血清的等体积混合物。由此，利用该试剂盒进行LppZ抗体水平检测和结核病诊断 时结果更加真实可靠。
[0025]根据本发明的一些具体示例，所述标准样品为所述多例LppZ抗体表达为阳性的血 清的等体积混合物的梯度稀释产物，所述梯度稀释的比例从1:50起至1:2000止。由此，利用 该试剂盒进行LppZ抗体水平检测和结核病诊断时结果可靠度高。
[0026]根据本发明的实施例，所述LppZ抗体识别的抗原多肽的浓度为lμg/ml。
[0027] 根据本发明的实施例，所述样品为血清。
[0028] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0029] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0030] 图1显示了根据本发明一个实施例，多肽芯片1的显影结果；
[0031] 图2显示了根据本发明一个实施例，多肽芯片2的显影结果；以及
[0032]图3显示了根据本发明一个实施例，SEQ ID No: 1-3所示多肽独立使用及联合使用 时，对结核病患者血清和健康人群血清中的LppZ抗体水平的检测结果。
【具体实施方式】
[0033]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为 对本发明的限制。
[0034] LppZ抗体识别的抗原多肽
[0035]在本发明的第一方面，本发明提出了一种LppZ抗体识别的抗原多肽。根据本发明 的实施例，其多肽活性片段为下列至少之一：
[0036] 1)SEQ ID No:l所示序列：SGCARFNDAQSQPFT;
[0037] 2)SEQ ID吣：2所示序列4?0"服01'撤撤歡；
[0038] 3)SEQ ID吣：3所示序列：撤撤歡0?0306·;
[0039] 4)选自SEQ ID No: 1-3所示氨基酸序列的至少两种的连接产物，
[0040] 5)1)-4)所述的多肽活性片段经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨 基酸衍生序列。
[0041] 发明人惊奇地发现，利用本发明的上述LppZ抗体识别的抗原多肽，通过免疫印迹 检测手段可有效检测待测者血清中的LppZ抗体水平，进而基于待测者血清LppZ抗体表达水 平是否较健康人显著升高，能够有效进行结核病诊断，确定待测者是否为疑似结核病患者。 其中，结核病患者血清LppZ抗体表达水平较健康人显著升高。并且，根据本发明的实施例， 本发明的上述抗原多肽LppZ抗体识别特异性好，LppZ抗体水平检测效率高，且制备简单，成 本低，易于进行工业化生产，利于大量推广应用。
[0042]需要说明的是，上述多肽均来自于LppZ蛋白的全长序列（例如来源于蛋白质公共 资源数据库uni-prot)所对应的位置。另外，在本文中所使用的术语"多肽"是指至少两个氨 基酸通过肽键连接而得到的寡聚物，其中，多肽中所包含的氨基酸残基的数目并不受特别 限制。根据本发明的一些实施例，多肽可以含有15个氨基酸。当然，本领域技术人员可以理 解的是，还可以对上述多肽进行化学修饰，以便增加多肽的抗原性，有助于多肽包被到 ELISA板底。根据本发明的实施例，利用具有上述氨基酸序列的多肽，能够有效地检测样品， 例如结核病或疑似结核病患者的血液样品（例如血清样品）中的LPPZ抗体水平。发明人发现 从LppZ蛋白完整序列得到的上述多肽可以模拟LppZ的抗原表位，能够与血液样本中LPPZ抗 体特异性的反应，因而，可以有效地用于检测对象血液样本中的LPPZ抗体水平，由此，可以 有效地用于筛查结核病疑似患者血清，为结核病的诊断提供了一个新的检测手段。
[0043] 上述抗原多肽可通过化学合成得到，也可以通过基因工程技术得到，此技术为行 业内所熟悉。本领域技术人员可以理解的是，可以有效地通过常规合成方法，合成上述多 肽，从而代替重组表达的生物合成方式。
[0044] 根据本发明的实施例，可以用上述多肽进行检测的样品的类型并不受特别限制。 根据本发明的实施例，优选的样品为来自结核病或疑似结核病患者的血液样本。由此，可以 利用多肽检测结核病或疑似结核病患者的血液样本中的LPPZ抗体水平，由此可以确定患者 是否患有结核病，为结核病检测提供辅助手段，或者提供结核病的早期筛查。另外，还可以 通过检测对象血液中的LppZ抗体水平，而对患者进行治疗的疗效评估监测分析。
[0045]利用本发明的多肽检测样品中LppZ抗体水平的方法并不受特别限制，包括但不限 于ELISA、液相芯片、固相芯片及其它免疫杂交技术等。根据本发明的实施例，可以通过酶联 免疫吸附试验(ELISA)法，借助本发明的多肽检测样品中的LppZ抗体水平。由此，可以进一 步提高利用多肽检测结核病或疑似结核病患者的血液样品中的LppZ抗体水平的效率。作为 示例，可以采用下列方法利用多肽检测结核病或疑似结核病患者的血液样品中的LppZ抗体 水平：
[0046]首先，用ρΗ9·6的碳酸盐缓冲液(NaC03 0.159g，NaHC03 0.293g，加水至 100ml，pH值 为9.6)稀释多肽至以8/!111，以10(^1/孔的量加入到96孔酶标板的孔中，封板膜密封后4°(：过 夜。
[0047] 接下来，弃去孔中的液体，0.1%TBS-T洗涤缓冲液(含0. l%TWeen-20的TBS-T溶液 配制为NaCl 8.7g，Tris 1.21g，加去离子水至 1000ml，pH 7.5,再加入Tween-20 lml)洗涤 酶标板5次，每次3min。
[0048] 接着，向孔中添加含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封闭缓冲液（其配制方法 为：NaCl 0.87g，Tris 0.121g，加去离子水至 100ml，pH 7.5,再加入Tween-20 0.5ml， BSA5g)，每孔300μ1，封板膜密封后37°C孵育lh。
[0049] 接着，添加标准品和待测样品。用上述含5 % BSA和0.05 % Tween-20的TBS-T封闭缓 冲液稀释待测血清，稀释比例为1:100。梯度稀释作为标准品的血清，稀释比例从1:50起至 1:2000止。完全弃去孔中液体，每孔加待测样品的血清稀释液100μ1，每例待测样品的血清 样本3个复孔，每板设立2个阳性对照孔，加入已知阳性血清，且每板设立2个空白对照孔，加 入0.1 % TBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后37 °C孵育2h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次 3min〇
[0050] 接着，进行第二抗体免疫反应。利用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封闭 缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:5000，每孔加10(^1，封板膜密 封后37 °C孵育lh。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
[0051 ]接着，加底物显色。按照常规ELISA试剂盒说明书(例如康为世纪TMB显色试剂盒）， 加入显色底物，每孔加入1〇〇μ1，室温避光条件下显色lOmin，每孔加入50μ1 2M H2SO4终止反 应。
[0052]接着，酶标仪492nm波长条件下测定光密度0D值。
[0053]最后，基于所得的光密度0D值与标准品浓度拟合的标准曲线，获得对应检测样品 的相对浓度，然后与预定参考值进行比较，确定待测样本是否来源于患有结核病患者。 [0054]根据本发明的实施例，可以利用确诊癌症患者和健康人(健康志愿者）的血液样品 进行平行试验所得到的数值作为预定的参考值。
[0055]设当待测样本中的LppZ抗体相对浓度高于X，则待测血清为疑似结核病患者血清。 X是发明人通过实验计算获得，具体方法为检测人群中结核患者和健康人血清抗体相对浓 度的受试者工作曲线(R0C曲线)最优点下的相对浓度。根据本发明实施例，采用82例结核患 者血清样本和38例健康人血清样本，计算得序列SEQ ID NO: 1所示抗原多肽的X值为6.86。 [0056] LPPZ抗体识别的抗原多肽的应用
[0057]在本发明的第二方面，本发明提供了前面所述的LppZ抗体识别的抗原多肽在制备 检测血清中LppZ抗体水平的试剂盒中的用途。
[0058]如前所述，采用制备的试剂盒，利用其包含的LppZ抗体识别的抗原多肽，通过免疫 印迹检测手段可有效检测待测者血清中的LppZ抗体水平，进而能够有效进行结核病诊断。 从而，根据本发明的实施例，该试剂盒用于结核病诊断。其中，基于结核病患者血清LppZ抗 体表达水平较健康人显著升高，能够有效对待测者进行结核病诊断。
[0059]为此，在本发明的第三方面，本发明提供了一种用于检测样品中LppZ抗体水平的 试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的LppZ抗体识别的抗原多肽。根据 本发明的实施例，利用该试剂盒能够有效检测样品中LppZ抗体水平，进而基于结核病患者 血清LppZ抗体表达水平较健康人显著升高，能够有效对待测者进行结核病诊断。
[0060] 具体地，根据本发明的实施例，所述LppZ抗体识别的抗原多肽以下列的至少一种 形式提供：
[0061] 1)96孔板，所述96孔板的孔中包被所述LppZ抗体识别的抗原多肽；
[0062] 2)微球，所述微球偶联所述LppZ抗体识别的抗原多肽。
[0063]进一步，根据本发明的一些具体示例，该试剂盒进一步包括：阳性对照样品，所述 阳性对照样品为抗LppZ蛋白的抗体(可以人工制备获得）。由此，利用该试剂盒进行LppZ抗 体水平检测和结核病诊断时，结果更加可靠。
[0064]根据本发明的实施例，进一步包括:标准样品，所述标准样品为多例LppZ抗体表达 为阳性的血清的等体积混合物。由此，利用该试剂盒进行LppZ抗体水平检测和结核病诊断 时结果更加真实可靠。其中，阳性血清的例数也即血清的患者来源数并不受特别限制，所述 "多例"也可以为1例。根据本发明的一些具体示例，所述标准样品为10例LppZ抗体表达为阳 性的血清等体积混合组成的血清池。
[0065]根据本发明的一些具体示例，所述标准样品为所述多例LppZ抗体表达为阳性的血 清的等体积混合物的梯度稀释产物，所述梯度稀释的比例从1:50起至1:2000止。其中，经剃 度稀释是为了方便后续绘制标准曲线。由此，利用该试剂盒进行LppZ抗体水平检测和结核 病诊断时结果可靠度高。
[0066]根据本发明的实施例，所述LppZ抗体识别的抗原多肽的浓度为lμg/ml。
[0067] 根据本发明的实施例，所述样品为血清。
[0068] 根据本发明的一些实施例，该试剂盒可以包括:96孔板，所述96孔板的孔中包被前 面所述的LPPZ抗体识别的抗原多肽。进一步，该试剂盒可以进一步包括：阳性对照样品，所 述阳性对照样品为抗LppZ蛋白的抗体，或者/额外地可以进一步包括:标准样品，所述标准 样品为LppZ抗体表达为阳性的血清经梯度稀释后的组合。根据本发明的一些具体示例，所 述标准样品为所述多例LppZ抗体表达为阳性的血清的等体积混合物的梯度稀释产物，所述 梯度稀释的比例从1: 50起至1: 2000止。根据本发明的实施例，所述LppZ抗体识别的抗原多 肽的浓度为lμg/ml。根据本发明的实施例，所述样品为血清。
[0069] 根据本发明的实施例，所述样品为来自结核病或疑似结核病患者的血液样品。由 此，可以利用多肽检测结核病或疑似结核病患者的血液样品中的LppZ抗体水平，由此可以 确定患者是否患有结核病，为结核病检测提供辅助手段，或者监控结核病的进展。另外，利 用该试剂盒还可以通过检测对象血液中的LppZ抗体水平，而对患者对治疗方法的反应进行 预后。
[0070] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于检测样品中LPPZ抗体水平的试剂 盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括:前面所述的LppZ抗体识别的抗原多肽。由此，利用 根据本发明的实施例，可以有效地借助根据本发明的LppZ抗体识别的抗原多肽对样品中的 LppZ抗体水平进行检测。根据本发明的实施例，该试剂盒可以进一步包括:适于进行ELISA 检测的试剂。由此，可以通过ELISA检测方法，利用根据本发明的多肽对样品中的LppZ抗体 进行检测，从而可以进一步提高利用多肽检测结核病或疑似结核病患者的血液样品中的 LppZ抗体水平的效率。根据本发明的实施例，所述多肽设置于96孔板中，例如可以包被96孔 板的孔，例如可以通过常规处理如借助包被液和阻滞液进行。由此，可以方便地高通量地进 行检测。可以进一步提高利用多肽检测结核病或疑似结核病患者的血液样品中的LppZ抗体 水平的效率。试剂盒中还可以包含其他试剂，例如洗涤缓冲液，样品稀释缓冲液，TMB底物溶 液，反应终止液，辣根过氧化物酶标记的二抗，阳性对照样品，标准样品。其中，阳性对照样 品为抗LppZ蛋白的抗体，标准样品为LppZ抗体表达为阳性的血清经梯度稀释后的组合。或 者，所述标准样品为所述多例LppZ抗体表达为阳性的血清的等体积混合物的梯度稀释产 物。
[0071] 根据本发明的实施例，所述样品为来自结核病或疑似结核病患者以及健康志愿者 的血液样品。
[0072]另外，利用该试剂盒还可以通过检测对象血液中的LppZ抗体水平，而对患者对治 疗方法的反应进行预后。
[0073]下面通过具体实施例，对本发明进行解释。需要说明的是，下列实施例仅仅是说明 性的，并不以任何方式限制本发明。另外，下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市 售可得的，如在下列实施例中没有明确指出的操作，可以通过本领域技术人员常规的操作 方法进行。
[0074]实施例1多肽的制备 [0075] 1.肽库的制备
[0076] LppZ(Rv3006)的氨基酸序列从蛋白质公共资源数据库uni-prot获得，其序列从N 端到C端如下：
[0078] LppZ蛋白全长序列拆分成一组15个氨基酸长度的多肽，相邻多肽之间顺序重叠 12 个氨基酸残基，组成LppZ肽库，共计121条。
[0079] 2.原位合成LppZ蛋白肽库制备多肽芯片(peptide array)
[0080]根据蛋白及多肽氨基酸残基长度、重叠序列长度进行多肽合成仪ASP SL(德国， intavis公司)MutilPep合成控制程序设定，依据程序控制在每个合成周期添加一种特定氨 基酸到活化的硝酸纤维素膜表面合成位点，并催化氨基酸之间肽键形成。合成肽链长度为 15个氨基酸残基，需进行15个周期的反应，按照ASP SL多肽合成仪的操作流程，将20种 FM0C-基团保护的天然氨基酸溶液放到机器上对应的位置。每个周期之间氨基酸要经过帽 化，FM0C-基团脱保护等一系列的过程才能与下一个氨基酸结合，最后一个周期结束时，要 将氨基酸的侧链保护基团脱掉。多肽芯片合成后于一 20°C密封保存备用。
[0081 ]实施例2筛选与结核病相关的多肽(抗原表位的筛选）
[0082] 1.多肽芯片的水化和免疫印迹
[0083]将实施例1制备的多肽芯片(这里称为"多肽芯片Γ)浸入40ml 100%乙醇中，摇床 上摇5分钟。然后，将该多肽芯片浸入40ml 75%乙醇中，摇床上摇5分钟。接下来，将多肽芯 片浸入40ml 50%乙醇中，摇床上摇5分钟。接着，加入150ml PBS浸泡30分钟。最后，将将多 肽芯片浸入40ml 5%脱脂奶粉/PBS-T溶液中，室温下孵育3小时进行封闭。
[0084] 将下述初筛和鉴定实验中涉及的血清样本用5%脱脂奶粉/PBS-T溶液1:1000稀释 制备成免疫反应液，将多肽芯片放入杂交袋内，按〇. Iml/cm2加反应液，去除袋内所有气泡， 封膜机封口，4°C轻轻振荡过夜。
[0085]血清免疫反应结束后，剪开杂交袋，弃去反应液，PBS-T 40ml洗多肽芯片3次，每次 15分钟，将多肽芯片放入杂交袋内，加1:2000稀释的山羊抗人IgG溶液，按0.1ml/cm2加二抗 反应液，封好杂交袋，室温下轻轻振荡2小时，40ml PBS-T洗膜3次，每次15分钟。
[0086] 接下来，进行ECL显影，曝光，曝光结果用AlphaView软件系统分析图像。
[0087] 2.抗原表位的初筛
[0088] 将10例结核病患者外周血血清等量混合制备成结核混合血清池，10例PPD检测阴 性志愿者外周血血清等量混合制备成健康混合血清池。上述血清池与多肽芯片按照上述方 法进行免疫杂交，根据免疫反应结果，挑选与结核病患者血清反映阳性且健康志愿者血清 反映阴性的差异多肽位点，共计16个，即为LppZ蛋白在结核血清中的抗原识别表位。多肽芯 片显影结果如图1所示。
[0089]图1显示了多肽芯片1的显影结果，其中黑色方框所示为LppZ蛋白肽库所在区域。
[0090] 3.具有结核病诊断价值的抗原多肽筛选
[0091] 按照实施例1所述的制备方法，制备包含上述16条差异多肽及对照在内的多肽芯 片（这里称为"多肽芯片2"），通过与100例结核病患者血清和90例健康人血清进行免疫反 应，筛选出LppZ抗原表位高频位点3个，它们具有区分结核病患者和健康人的价值，其序列 和在结核血清中的阳性率如表1所示，多肽芯片2显影结果如图2所示：
[0092] 表 1
[0094]图2显示了多肽芯片2的显影结果，其中黑色方框内所示为LppZ多肽所在区域。
[0095] 实施例3 ELISA检验
[0096] 以实施例2中筛选获得的三种多肽(表1所示)为抗原分别包被96孔板，运用ELISA 方法对下列样本进行LppZ抗体的检测:82例结核患者血清和38例健康对照血清。
[0097]具体检测方法如下：
[0098]首先，用多肽合成仪MultiPep RS按照序列表中氨基酸残基顺序合成所述抗原多 肽。
[0099]接着，用ρΗ9·6的碳酸盐缓冲液(NaC03 0.159g，NaHC03 0.293g，加水至 100ml，pH值 为9.6)稀释多肽至以8/!111，以10(^1/孔的量加入到96孔酶标板的孔中，封板膜密封后4°(：过 夜。
[0100] 接下来，弃去孔中的液体，〇. 1%TBS-T洗涤缓冲液(含0. l%Tween-20的TBS-T溶液 配制为NaCl 8.7g，Tris 1.21g，加去离子水至 1000ml，pH 7.5,再加入Tween-20 lml)洗涤 酶标板5次，每次3min。
[0101] 接着，向孔中添加含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封闭缓冲液（其配制方法 为：NaCl 0.87g，Tris 0.121g，加去离子水至 100ml，pH 7.5,再加入Tween-20 0.5ml， BSA5g)，每孔300μ1，封板膜密封后37°C孵育lh。
[0102] 接着，添加标准品和待测样品。所述标准品为随机选取的其中10例结核病患者的 外周血血清的等体积混合物。用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封闭缓冲液稀释 待测血清，稀释比例为1:100。梯度稀释作为标准品的血清混合物，稀释比例从1:50起至1: 2000止。完全弃去孔中液体，每孔加待测样品的血清稀释液100μΙ，每例待测样品的血清样 本3个复孔，每板设立2个阳性对照孔，加入已知阳性血清，且每板设立2个空白对照孔，加入 0.1 % TBS-T洗涤缓冲液。封板膜密封后37 °C孵育2h。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次 3min〇
[0103] 接着，进行第二抗体免疫反应。利用上述含5%BSA和0.05%Tween-20的TBS-T封闭 缓冲液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG，稀释比例1:5000，每孔加10(^1，封板膜密 封后37 °C孵育lh。弃去孔中液体，洗涤酶标板5次，每次3min。
[0104] 接着，加底物显色。按照常规ELISA试剂盒说明书(康为世纪TMB显色试剂盒），加入 显色底物，每孔加入1〇〇μ1，室温避光条件下显色lOmin，每孔加入50μ1 2M H2SO4终止反应。 [0105]接着，酶标仪492nm波长条件下测定光密度0D值。
[0106] 最后，基于所得的光密度0D值与标准品浓度拟合的标准曲线，获得对应检测样品 的相对浓度，然后与预定参考值进行比较，确定待测样本是否来源于患有结核病患者。
[0107] 设当待测样本中的LppZ抗体相对浓度高于X，则待测血清为疑似结核病患者血清。 X为检测人群中结核患者和健康人血清抗体相对浓度的受试者工作曲线(R0C曲线）最优点 下的相对浓度。基于采用82例结核患者血清样本和38例健康人血清样本，计算得到各抗原 多肽对应的X值，其中序列SEQ ID NO: 1所示抗原多肽的X值为6.86。
[0108] 检测结果如图3所示，SEQ ID N0:l-3所示的多肽无论独立使用或者联合使用，均 检测到结核病患者血清中LppZ抗体水平均显著高于健康人群血清。
[0109] 综上所述，发明人发现，结核病患者的LppZ抗体水平均显著高于健康人群血清。由 此，证明了本发明的LppZ抗体识别的抗原多肽，可有效用于结核病的辅助诊断。
[0110] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何 的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 Com]尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解:在不 脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本 发明的范围由权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 一种LppZ抗体识别的抗原多肽，其特征在于，其多肽活性片段为下列至少之一： 1. SEQ ID N0:1 所示序列：SGCARFNDAQSQPFT; 2. SEQ ID勵:2所示序列4?0"服01'撤撤歡； 3. SEQ ID 勵:3所示序列：拟拟141^1?〇306·; 4) 选自SEQ ID N0:l-3所示氨基酸序列的至少两种的连接产物， 5) 1) _4)所述的多肽活性片段经氨基酸残基的修饰、取代、缺失或添加而形成的氨基酸 衍生序列。2. 权利要求1所述的LppZ抗体识别的抗原多肽在制备检测血清中LppZ抗体水平的试剂 盒中的用途。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述试剂盒用于结核病诊断。4. 一种用于检测样品中LppZ抗体水平的试剂盒，其特征在于，包括： 权利要求1所述的LppZ抗体识别的抗原多肽。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述LppZ抗体识别的抗原多肽以下列的 至少一种形式提供： 1) 96孔板，所述96孔板的孔中包被所述LppZ抗体识别的抗原多肽； 2) 微球，所述微球偶联所述LppZ抗体识别的抗原多肽。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：阳性对照样品，所述阳性对 照样品为抗LppZ蛋白的抗体。7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括:标准样品，所述标准样品为 多例LppZ抗体表达为阳性的血清的等体积混合物。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述标准样品为所述多例LppZ抗体表达 为阳性的血清的等体积混合物的梯度稀释产物，所述梯度稀释的比例从1: 50起至1: 2000 止。9. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述LppZ抗体识别的抗原多肽的浓度为 lμg/ml〇10. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述样品为血清。
【文档编号】G01N33/569GK105884872SQ201610330711
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】岳文涛, 谭金晶, 顾勐, 张丽娜
【申请人】首都医科大学附属北京胸科医院, 北京市结核病胸部肿瘤研究所