专利名称：：诊断结核病的基于结核杆菌抗原性多肽的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及结核病的诊断领域。更具体而言涉及使用源于结核杆菌的多种抗原性多肽的组合诊断结核病的领域。
背景技术：
：近年来，结核病死灰复燃，成为全球关注的公共卫生问题和社会问题。据统计，目前全球有肺结核病人2000万，新发病人1000万，每年死亡人数300万，超过了其它传染病的总和，成为传染病的头号杀手。肺结核显示出全球性流行病的所有主要特征，并在全世界范围内蔓延。地球上大约有1/3的人感染结核杆菌，导致每年800万例活动性肺结核和300万人死亡。结核杆菌多重药耐药抹的出现以及合并HIV感染使得形势变得更为严峻。如果不能有效控制，在未来10年内，大约有3000万人会因此而丧命，还有9000万活动性结核新发病例。结核如此强大的流行性和传染性对公众健康来说是一个巨大的挑战，人们迫切需要解决这些问题的方法，然而现存的一些对抗结核的策略是远远不够的，尤其在诊断方法中存在着较多问题。目前结核病的诊断虽然有多种方法，但都存在这样或那样的问题。影像学诊断虽然仍是主体，但是它需要其它辅助诊断方法；痰涂片简单易行，但阳性率低；痰培养是金标准，但周期太长，不能满足临床需要；PCR法敏感性高、诊断速度快，但存在不稳定性；噬菌体裂解法可以检测活结核杆菌，不能检测非结核杆菌感染，更加适用于结核菌抗药性实验研究；而血清学诊断技术有其固有的优势，如操作简便、快速、易判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等。找高敏感性和高特异性的抗原成分，建立高特异性高敏感性的检测方法是解决结核病早期快速准确诊断的关键。目前越来越多的兴趣投向建立一种特异性和灵敏性都比较可靠的血清学结核病诊断方法。传统上使用的结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)所包含的抗原为致病性分支杆菌、环境分支杆菌及卡介苗(BCG)所共有，不能明确区分BCG免疫、环境分支杆菌感染和致病性结核杆菌感染。目前研究的用于诊断结核病的最重要的抗原包括38kD抗原、ESAT-6、CFPIO、MPT64等，这些都作为血清学检测活动性结核的标志物。38kD抗原是一种脂蛋白和主要免疫原，是目前最为常用的结核病诊断抗原之一。38kD抗原是结核杆菌种特异性蛋白质抗原且含量高于BCG10倍。在用于结核血清学检测时，该蛋白的敏感性和特异性优于其它单一抗原。有研究证实用38kD抗原检测肺结核病人血清，灵敏度与特异性分别为65.6%和95.8%(WilKinson等，JClinMicrobiol,35(3):553画557(1997))。早期分泌性抗原靶(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP10)是结核病免疫诊断中两个很有前途的抗原，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫应答中起重要作用。这两个抗原均由RD1区编码，该区只存在于致病性结核杆菌基因组中，所有BCG菌抹基因组中均缺乏该区域(MahairasGG等，Bacteriol，178:1274-1282(1996))。ESAT-6和CFP10可形成异二聚体结构，联合应用ESAT-6和CFP10i貪断结核病发现混合抗原敏感性较单抗原增加，而不降低其特异性(vanPinxterenLAH等，ClinDiagnLabImmunol,7(2):155-160(2000))。所以，ESAT-6和CFP10有望成为诊断动物和人致病性结核杆菌感染的特异性抗原。MPT64是结核杆菌生长最早分泌的主要蛋白，仅在结核杆菌及牛型分支杆菌中存在，而作为疫苗的BCG中则不含。天然的MPT64和重组的MPT64均可使结核病人或结核菌素阳性者产生T细胞反应和皮肤延迟型(DTH)超敏反应。但由于MPT64只存在于结核杆菌复合群中，大多数BCG菌林缺乏MPT64基因，BCG接种者或环境分支杆菌感染者(如鸟分支杆菌)对MPT64皮肤试验不反应。有研究结果表明，虽然以MPT64蛋白作为抗4原检测抗结核抗体的阳性率在各种结核杆菌分泌性蛋白中是较低的，但如果与其它蛋白形成融合蛋白则有可能具有较好的稳定性(vanPinxterenLAH等，ClinDiagnLabImmunol,7(2):155-160(2000))，因此MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。Mtb8.4(Rvll74c)、Mtb8(Rv0379)和Mtbl6.3(Rv2185c)广泛存在于结核杆菌(包括BCG)中，其在结核病诊断方面的意义仍然不清楚。Mtb8.4是新近从结核杆菌培养物滤液中纯化分离得到的一种的低分子量蛋白抗原，Coler等学者(JImmunol.,161:2356-2364(1998))的研究更进一步揭示Mtb8.4是患有潜伏结核杆菌感染的个体中重要的免疫活性T细胞抗原，在确定致病性结核杆菌感染中具有重要作用。Mtb8是可能的转运蛋白质，仅在Houghton等(ClinDiagnoLabImmun,9(4):883陽891(2002))的研究中将Mtb8与其它几种抗原(Mtbll、Mtb48、38kD等)组成融合抗原用于检测结核病，表明Mtb8与其它几种抗原一起有可能增强38kD抗原的反应活性。Mtb16.3是一种未知功能蛋白质，有研究表明Mtbl6.3与Mtb9.7组合有助于提高对与HIV共感染的结核病患者的检出率。但在本领域，还没有找到在检测结核病方面敏感性和特异性均令人满意的组合。经过本发明的工作，令人惊奇地发现了Mtbl6,3特异表位抗原肽段在检测结核病方面的独特优势，其与选自38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种特异表位抗原肽段相组合可以使结核病的检测敏感性和特异性均提高。发明简述本发明涉及用于检测结核杆菌的组合物，其包含结核杆菌Mtbl6.3的特异表位抗原肽段与选自38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种结核杆菌特异表位抗原肽段的组合；其中Mtbl6.3特异表位抗原肽段为SEQIDNO:14所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，38kD特异表位抗原肽段为SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，ESAT-6特异表位抗原肽段为SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，CFP10特异表位抗原肽段为SEQIDNO:6所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，MPT64特异表位抗原肽段为SEQIDNO:8所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。在本发明的另一个实施方案中，组合物还含有选自Mtb8和Mtb8.4的至少一种结核杆菌特异表位抗原肽段；其中Mtb8特异表位抗原肽段为SEQIDNO:IO所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，Mtb8.4特异表位抗原肽段为SEQIDNO:12所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。在本发明的一个实施方案中，在组合物中各个特异表位抗原肽段单独存在。在本发明的一个优选实施方案中，在组合物中一些特异表位抗原肽段以融合蛋白质的形式存在。在一个更优选的实施方案中，38kD、ESAT6和CFP10特异表位抗原肽段作为融合蛋白质存在。在本发明的一个更优选的实施方案中，在组合物中38kD、ESAT6和CFP10特异表位抗原肽段以一个融合蛋白质的形式存在，MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特异表位抗原肽段以另一个融合蛋白质的形式存在。在本发明的最优选的实施方案中，一个融合蛋白质从N末端至C末端依次为38kD、ESAT6和CFP10特异表位抗原肽段，另一个融合蛋白质从N末端至C末端依次为Mtb8.4、MPT64、Mtbl6.3和Mtb8特异表位抗原肽段。附图简述图1-7.结核杆菌蛋白质38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3的表位分析。图8-14.所选择的结核杆菌蛋白质38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3中的特异表位抗原肽段的编码DNA序列以及氨基酸序列。图15.融合抗原肽段38kD-ESAT6-CFP10的编码DNA序列以及氨基紗列。图16.融合抗原肽段Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-Mtb8的编码DNA序列以及氨基酸序列。发明详述在结核杆菌的血清学检测领域，还没有一种抗原能够高特异性和敏感性地检测出结核杆菌。在结核杆菌血清学检测方面具有互补作用的抗原组合是特别有利的。对于检测结核杆菌而言，有效的特异表位抗原肽段的确定可以通过多种方法进行。示例性的方法例如使用软件如BIOSUN预测蛋白质的表位；然后选取具有一个或多个表位、尤其是优势表位(能够激发较强的免疫反应的表位)的肽段；通过常规的分子生物学方法钓取其编码序列并表达出该抗原多肽；通过例如ELISA方法检测抗原多肽对不同血清的反应性。对结核病患者血清具有反应性而对非结核病患者血清不具有反应性的抗原多肽是可用于本发明的有效的特异抗原多肽。通过使用不同的特异表位抗原肽段对于同一组血清样品进行反应性检测，可以找到在血清反应性方面具有互补性的特异表位抗原肽段。虽然，其机制尚未完全明了，但这种特异表位抗原肽段的组合使得结核杆菌的血清学检测的特异性和灵敏度提高。应当指出的是，对所选择抗原肽段进行适当的修饰仍然具有检测效果。例如对其中个别氨基酸进行保守替换、增加或缺失，个别氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸，通过此类修饰得到的多肽在本文中称作功能变体。保守氨基酸替换的实例例如Ala、Val、Leu和Ile间的替换；Ser和Thr间的替换；酸性残基Asp和Glu间的替换；Asn和Gin间的替换；和碱性残基Lys和Arg间的替换；或者芳香族残基Phe和Tyr间的替换。对于不同肽段融合的抗原，本领域众所周知其构建原则和方法。具体而言，为了不影响待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之间添加一个接头。关于接头的选择具体可参见(AraiR等，ProteinEnginering，14(5):529曙532(2001))。抗原蛋白质的克隆、表达以及纯化可通过多种方法进行。具体方法参见《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002,第1217-1270页。适宜的原核表达载体如pEGX系列原核表达载体(AmershamPharmacia公司)、pET系列原核表达载体(Novagen公司)等。特别优选pGEX-4T-2栽体。检测方法可以有多种，例如间接酶联免疫测定技术、双抗原夹心酶免疫测定技术、金标快速检测技术、免疫渗滤检测技术、蛋白芯片检测技术等。优选间接酶联免疫测定(间接ELISA)方法。以下结合具体实施例详细说明本发明，但不应构成对本发明实施范围的限定。实施例实施例l:7种结核杆菌特异表位抗原肽段的确定利用BIOSUN生物学分析软件分别分析了7种结核杆菌抗原38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3的表位分布情况，首先输入其氨基酸序列，然后寻找B细胞表位，所得表位分布图示于图1-7。根据表位分布图最终确定特异表位抗原肽段。其中结核杆菌抗原38kD的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基酸序列分别为SEQIDNO:l和SEQIDNO:2;结核杆菌抗原ESAT-6的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基酸序列分别为SEQIDNO:3和SEQIDNO:4;结核杆菌抗原CFP10的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基酸序列分别为SEQIDNO:5和SEQIDNO:6;结核杆菌抗原MPT64的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基酸序列分别为SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;结核杆菌抗原Mtb8的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基酸序列分别为SEQIDNO:9和SEQIDNO:10;结核杆菌抗原Mtb8.4的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基酸序列分别为SEQIDNO:ll和SEQID8NO:12;结核杆菌抗原Mtbl6.3的特异表位抗原肽段的编码DNA序列和氨基餅列分别为SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。实施例2:单独的7种结核杆菌特异表位抗原肽段的制备1.特异表位抗原肽段基因的克隆根据特异表位抗原肽段的核苷酸序列设计并合成了上下游引物，所使用的限制性内切酶分别为5fl附FI和I。用于扩增特异表位抗原肽段38kD的引物序列如下38kD画F:5'-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3，38kD-R:5，-GCTCGAGGCTGGAAATCGTCGCGA画3'用于扩增特异表位抗原肽段ESAT6的引物序列如下ESAT6-F:5，誦GGGATCCCATTCCCTCCTTGACGA國3，ESAT6-R:5，-GCTCGAGGTTCAGCTCGGTAGCCGT-3，用于扩增特异表位抗原肽段CFP10的引物序列如下CFP10画F:5，-CGGATCCGAAGCAGCCAATAAGCAG國3，CFP10-R:5，画GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG誦3"用于扩增特异表位抗原肽段MPT64的引物序列如下MPT64-F:5'-GGGATCCCCCAAGACCTACTGCGA國3，MPT64-R:5'-GCTCGAGCGGCGCTATCGATACCT画3，用于扩增特异表位抗原肽段Mtb8的引物序列如下Mtb8-F:5，誦GGGATCCACCAGCCCCACATCCT画3，Mtb8醫R:5，-GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA-3'用于扩增特异表位抗原肽段Mtb8.4的引物序列如下Mtb8.4画F:5，-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA画3，Mtb8.4-R:5，誦GCTCGAGTTGCGCGGCCATGGCA國3，用于扩增特异表4立抗原肽段Mtbl6.3的引物序列如下Mtbl6.3誦F:5，-GGGATCCCGGACAAGACGACACAGA誦3，Mtbl6.3-R:5,-GCTCGAGGCCCTCGACTCGTTTCTT-3，以结核杆菌菌抹H37Rv基因组DNA为模板，分别扩增了38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特异表位抗原肽段的基因片段。PCR扩增条件如下预变性95'C2分钟，变性94'C30秒；复性58。C30秒；延伸72"C30-90秒(随基因长度不同而不同)，扩增32个循环，再72'C延伸7分钟。PCR扩增所得的片段通过电泳鉴定，表明均得到相应大小的基因片段。2.表达载体的构建的pGEX-4T-2载体，测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。3.特异表位抗原肽段在大肠杆菌DH5oc中的表达与纯化用所得到的重组质粒转化大肠杆菌菌抹DH5ot,对PCR鉴定阳性克隆进行IPTG诱导。诱导后的菌体进行超声破碎，将上清液与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，室温轻摇30分钟。混合物于4"C以500g离心5分钟，小心去掉上清，在沉淀中加入10倍柱体积的PBS,颠倒离心管数次，洗去未与树脂结合的蛋白。于4。C以500g离心5分钟。重复洗涤过程2次。在每毫升树脂加入50单位溶于lmlPBS的凝血酶，颠倒离心管数次混匀，室温下振荡10-16小时。于4'C以500g离心5分钟，将上清小心转移至新管中。进行SDS-PAGE分析，结果表明获得了纯度较高的特异表位抗原肽段。实施例3:38kD-ESAT6-CFP10融合抗原的制备1.引物i殳计根据三个抗原基因及接头的序列设计了上下游引物，使用的限制性内切酶分别为fifl/Mi/I和JV7^1,所有引物均由上海英俊生物技术公司合成，其序列力口下38kD画F:5'-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3'38kD-RL:5'ACTACCGCCACCAGAGCTGGAAATCGTCGC-3，ESAT6-FL:5，AGCGGCGGCGGTAGCCATTCCCTCCTTGAC画3，ESAT6-RL:5，-AGAGCCACCGCCACTGTTCAGCTCGGTAGC3'CFP10陽FL:5，CTTCCGGTGGTGGCTCTGAAGCAGCCAATAA國3，CFP10画R:5'GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG陽3，2.载体构建以结核杆菌菌抹H37Rv基因组DNA为模板，分别扩增了38kD、ESAT-6和CFP10特异表位抗原肽段的基因片段。PCR扩增条件如下预变性95。C2分钟，变性94。C30秒；复性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(随基因长度不同而不同)，扩增32个循环，再72。C延伸7分钟。通过电泳鉴定，表明均得到相应大小的基因片段。然后以具有互补接头的基因片段互为模板进行扩增，将38kD、ESAT-6和CFPIO抗原基因片段连接到一起，构建融合抗原基因。将融合抗原基因片段用限制性内切酶酶切并连接入经相同限制性内切酶酶切的pGEX-4T-2载体，测序由利嘉富诚生物技术有限公司完成。3.抗原制备见实施例2。实施例4:MPT64-Mtb8-Mtb8.4-Mtb16.3融合抗原的制备根据4个抗原基因的序列设计了上下游引物，使用的限制性内切酶分别为BamHI和XhoI，所有引物均由上海英俊生物技术公司合成，其序列如下Mtb8.4誦F:5，-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3，Mtb8.4-RL:5-GCTACCACCGCCGGATTGCGCGGCCATGGCA画3，MPT64-FL:5，國GGTGGCGGCTCCCCCAAGACCTACT-3，MPT64-RL:5，-CTACCGCCACCAGACGGCGCTATCGATA-3，Mtbl6,3画FL:5'-GCGGCGGCGGTAGCGCGGACAAGACGACAC-3,Mtbl6,3國RL:5，-GAGCCACCGCCACTGCCCTCGACTCGTTTCT誦3'Mtb8-FL:5，-CCGGTGGTGGCTCTGCCGGGGTCGCCTCCG-3'Mtb8-R:5,-GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA-3"载体构建以及抗原制备见实施例3。实施例5:间接ELISA方法评价7种单独特异表位抗原肽段的抗原性分别以所选择的38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特异表位抗原肽段为抗原，应用间接ELISA方法初步检测了30例结核阴性血清样本，以其OD值的平均值+2SD为cutoff值，计算出38kD、ESAT國6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3的cutoff值分别为0.55、0.2、0.15、0.29、0.17、0.18和0.30。然后，再用这七种抗原分别检测了20例结核病人血清和10例正常人血清的抗结核抗体，表1中显示了所检测样品的OD值与cutoff值的比值(S/co-样品OD值/cutoff值)，比值大于l判定为阳性，比值大于2判定为强阳性，比值小于l判定为阴性。在初步检测中38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3七种抗原的敏感性和特异性分别如下38kD为75%和卯％、ESAT-6为45%和卯％、CFP10为80%和100%、MPT64为50%和卯%、Mtb8分别为55%和卯％,Mtb8.4分别为40%和卯％，Mtbl6.3分别为55%和80%。血液样本的反应性(S/co)NoStatus38kDESAT-6CFP10MPT64Mbt8Mbt8.4Mbtl6.3BP1TB0.230.581.122.750.660.200.47BP2TB1.211.661.210.891.510.181.28BP3TB1.133.838.122.343.040.222.55BP4TB1.390.540.420.430.570.180.56BP5TB0.441.211.431.181.270.181.36BP6TB1.551.659.131.630.870.190.78BP7TB1.440.891.040.680.810.531.32BP8TB1.511.211.710.721.241.061.53BP9TB2.310.281.010.946.241.121.26BP10TB1.710.690.610.610.820.390.75BP11TB2.110.591.450.881.741.251.18BP12TB0.390.580.633.960.820.360.83BP13TB1.081.071.010.891.751.290.71BP14TB0.830.722.171.512.001.371.05BP15TB1.860.985.291.182.167.161.23BP16TB1.031.129.461.210.710.460.41BP17TB2.331.164.651.632.035.262.11BP18TB1.670.361.570.711.152.010.36BP19TB0.870.390.680.410.510.242.96BP20TB1.891.471.311.220.320.180.61N-lDonor0.180.630.490.390.640.400.49N陽2Donor0.490.860.680.740.980.411.05N-3Donor0.590.980.450.380.640.30.62N-4Donor1.451.310.990.624.801.240.92N-5Donor0.240.590.560.970.840.581.03N-6Donor0.970.720.470.490.650.390.93N陽7Donor0.420.780.771.280.830.710.65N國8Donor0,580.860.350.740710.760.81N-9Donor0.330.550.960,960.930.870.61N-10Donor0.250.760.850.930.650.740.78敏感性75%45%80%50%55%40o/o55%特异性90%90%100%90%90%卯％80%我们注意到在这七种抗原中没有任何一种能够检出全部结核病患者，但令人惊奇地发现，Mtbl6.3特异表位抗原肽段在检测结核杆菌中具有独特的优势。当常用的四种抗原，即38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64,全部反应性为阴性时，Mtbl6.3特异表位抗原肽段则对该血清的反应性呈现强阳性(BP19)。由此可见，Mtbl6.3特异表位抗原肽段与38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64四种特异表位抗原肽段在血清学检测方面具有良好的互补性。Mtbl6.3特异表位抗原肽段与选择38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64的至少一种特异表位抗原肽段的组合有可能提高结核病诊断的敏感性。此外，虽然这七种抗原中没有任何一种能够检出全部结核病患者，但是七种抗原的联合检出率可以达到100%，抗原之间的这种互补性对于结核病患者的临床诊断是非常重要的。用不同抗原检测同一病人血清，其反应性有所不同，并且各抗原之间存在一定的互补性。这可能是由于结核杆菌抗原多而复杂，在宿主体内表现出不同的抗体镨。因此，联合应用多种抗原进行检测有可能在保证特异性的基础上有助于提高检测灵敏度，研制出高特异性和高敏感性诊断试剂。实施例6:间接ELISA方法评价Mtbl6.3特异表位抗原肽段与其余特异表位抗原肽段相组合在检出结核病患者中的效果如实施例5所述，由于Mtbl6.3特异表位抗原肽段具有其它抗原肽段所不具有的优点，因此设计实验验证其与四种常用抗原，即38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64,特异表位抗原肽段的一种或多种抗原舦段相组合在检出结核病患者中的效果。实验结果如表2所示。表2间接ELISA方法检测Mtbl6.3特异表位抗原肽段与其它特异表位抗原肽段混合对结核病人和正常人血液样本的反应性(S/co)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>BP9TB2.940.771.221.181.551.611,341.18BP10TB1.450.580.740.831.311.190.950.87BP11TB2.390.721.480.941,871.551.281.19BP12TB0.460.610.733.870.802.360.832.10BP13TB1.230.940.970.821.050.970.711.11BP14TB0.980.521.821.450.991.271.251.31BP15TB1.871.275.011.191.631.363.202.95BP16TB1.051.198.231.230.891.174.413.47BP17TB4.672.066.121.762.573.263.572.71BP18TB1.320.431.330.491.190.991.261.34BP19TB2.131.531.961.441.341.311.861.77BP20TB1.641.181.301.171.201.231.511.16N-lDonor0.350.620.570.600.750.760.720.83N-2Donor0.370.640.710.830.680.880.940.71JN-3Donor0.400.790.540.580.590.850.730.75N-4Donor1.321.250.980.621.090.911.181.20N-5Donor0.470.550.660,950.640.980.930.86N-6Donor0.760.540.730.490.750.710.930.78N-7Donor0.810.750.580.970.720.730.830.90N-8Donor0.880.850.830.740,690.830.810.75N-9Donor0.460.560.640.560.830.580.590.58N隱IODonor0.520.680.600.720.470.710.780.64敏感性85%55%80%70%80%85%80%90%特异性90%卯％100%100%卯0/0100%90%90%由表2可见，Mtbl6.3特异表位抗原肽段与其余一种或多种抗原肽段相组合在检出结核病患者中效果更好，检出率明显提高，特异性却没有降低。这表明1\1比16.3特异表位抗原肽段确实与其它特异表位抗原肽段在检出结核病患者方面存在互补性。联合应用多种抗原可以提高检出率，避免漏检。实施例7:间接ELISA方法评价融合抗原在检出结核病患者中的效果单独或组合应用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-Mtb8融合抗原包被酶联板，应用间接ELISA方法初步评价了融合抗原在检出结核病患者中的效果。在初步检测中，组合应用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-Mtb8融合抗原时，20例结核病患者的血清仅1例检测结果为阴性，其它19例均为阳性，其中9例为强阳性(S/co>2.0)，与临床结果的符合性达到95%。初步检测中10例健康献血员血清均为阴95%和100%(见表3)。以上结果显示7个抗原全部融合(3个融合在一起，另4个融合在一起)的效果更佳。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>BP17TB2.332.872.16BP18TB1.241.221.20BP19TB0.661.672.11BP20TB1.490.701.27N國lDonor0.850.630.35N-2Donor0.620.810.37N-3Donor0.550.420.40N誦4Donor1.321.690.97N-5Donor0.640.550.55N-6Donor0.950.370.47N-7Donor0.520.710.56N-8Do加r0.710.440.38N-9Donor0.680.820.46N-10Donor0.530.610.52敏感性85%75%95o/0特异性卯％卯％100o/0序列表序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所<120〉诊断结核病的基于结核杆菌抗原性多肽的组合物〈160>18<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211>1062<212>,*<213〉结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400〉1gcggcgggctgt.ggct.cgaa.accaccgagcggttxgcctgaaacgggcgccggcgccggt60actgtcgcgactacccccgcgtcgt.cgccggtgacgttggcggagsccggtagcacgctg120ctctacccgctgttcaacctgtggggtccggcctttcacgagaggtatccg犯cgtcscg180atcaccgctcagggcaccggttctggtgccgggstcgcgcsggccgccgcCggg3CggtC240aacattggggcctccgacgcctatctgtcgg卿gtgatatggccgcgcacaaggggctg300atgaacat.cgcgctagccatctccgctcagcaggtcaactacaacctgcccggagtgagc360gagcacctcaagctg犯cggaaaagtcctggCggCCEitgtaccagggcacC3tC3333CC420tgggacgacccgcagatcgc.tgcgctcaaccccggcgtgaacctgcccggcaccgcggta480gttccgctgcaccgctccgacgggtccggtgacaccttcttgttcacccagtacctgtcc540aagcaagatcccgagggctgggg，gtcgcccggcttcggcaccaccgtcgacttcccg600gcggtgccgggtgcgctgggtgag獄ggcaacggcggcatggtgaccggttgcgccgag6603caccgggctgcgtggcctatatcggcatcagcttcctcgaccaggccagtc33cgggga720ctcggcgaggcccaactaggcaatagctctggC33tttcttgtt.gcccgaCgCgC333gC780attcaggccgcggcggctggcUcgcat.cg33犯CCCCggcgaaccaggcgaUtcgatg840atcgacgggcccgccccggacggctacccgat.catcaactacgagtacgccat.cgtcaac900aaccggcaaaaggscgccgccaccgcgcagaccttgcaggcatttctgcactgggcgatc960accgacggcaacaaggcctcgttcctcgaccaggttcatttccagccgctgccgcccgcg1020gtggtgaagttgtctgacgcgttgatcgcgacgatt.tccagc1062<210>2〈211>354<212>PRT<213〉结核杆菌〈■〉2AlaAlaGlyCysGlvSerLysProProSerGlySerProGluThrGly151015AlaGlyAlaGlvThrValAlaThrThrProAlaSei.SerProValThi.202530LeuAlaGluThrGlySerThrLeuLeuTyrProLeuPheAsnLeuTrp354045GlyProAlaPheHisGluArgTyrProAsnValThrlieThrAlaGin505560GlyThrGlySerGlyAlaGlylieAlaGinAlaAlaAlaGlyThrVal1865707580AsnlieGlyMaSerAspAlaTyrLeuSerGluGlyAspMetAlaA1e8590%HisLysGlyLeuMetAsnlieAlaLeuAlalieSerAlaGinGinVal100105110AsnTyrAsnLeuProGlyValSerGluHisLeuLysLeuAsnGlyLys115'120125ValLeuAlaAlaMetTyrGinGlvThrlieLvsThrTrpAspAspPro130135140GinlieAlaAlaLeuAsnProGlyValAsnLeuProGlyThrAlaVal145150155160ValProLeuHisArgSerAspGlvSerGlyAspThrPheLeuPheThr165170175GinTyrLeuSerLysGinAspProGluGlyTrpGlyLysSerProGly180185190PheG1yThrThrValAspPheProAlaValProGlvAlaLeuGlyGlu195200205AsnGlyAsnGlyGlvMetValThrGlvCysAlaGluThrProGlyCys210215220ValAlaTyrlieGlvlieSerPheLeuAspGinAlaSerGinArgGly22523023524bLeuGlyGluAlaGinLeuGlyAsnSerSerGlvAsnPheLeuLeuPro245250255AspAlaGinSerlieGinAlaAlaAlaAlaGlyPheAlaSerLysThr260265270ProAlaAsnGinAlalieSerMetlieAspGlvProAlaProAspGly275280285TyrProlielieAsnTvrGluTvrAlalieValAsnAsnArgGinLys290295300AspAlaAlaThrAlaGinThrLeuGinAlaPheLeuHisTrpAlalie305310315320ThrAspGlyAsnLysAlaSerPheLeuAspGinValHisPheGinPro3^5330335LetiProProAlaValVslLvsLeuSerAspAlaLeulieAla丁hrlie340345350SerSer<210>3<211>123〈212〉腿〈213〉结核杆菌<400>3cattccct,ccttgacgaggggaagcagtccctgacca,agctcgcagcggcctggggcggt60agcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctg120aac123<400>4HisSerLeuLeuAspGluGlyLysGinSerLeuThrLvsLeuAlaAla15'10'15AlaTi'pGlyGlvSerGlvSerGluAlaTyrGinGlvValGinGinLys202530TrpAspAlaThrAlaThrGhiLeuAsn3540〈210>5<211〉111<212>醒〈213〉结核杆菌〈400〉5gaagcagccaataagcagaagcaggaactcgacgagatctcgacgaatattcgtcaggcc60ggcgtccaatactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcg111<210〉6〈211〉37<212〉PRT〈213〉结核杆菌<400>6GluAlaAlaAsnLysGinLysGinGluLeuAspGlulieSerThrAsn151015lieArgGinAlaGlvValGinTyrSerArgAlaAspGluGluGinGin202530GinAlaLeuSerSer35<210〉7<211>462<212〉隱<213〉结核杆菌<400〉7cccaagacctactgcgaggagttgaaaggcaccgataccggccaggcgtgcctga.ttcaa60atgtccgacccggcctacaacaccaacatcagcctgcccagt.tact.accccgaccagaag120tcgctggaaaat.tacatcgcccagacgcgcgacaagttcctcagcgcggcaacatcgtcc180actccacgcgaagccccctacgaattgaat,atcacctcggccacataccagtccgcgata240ccaccgcgtggtacgcaggccgtggtgctcaaggtctaccagaatgccggcggcacgcac300ccaacgaccacgtacaaggccttcgattgggaccaggcttatcgcaagccaatcacctat.360441PRT结核杆菌o123222220gacacgctgtggcaggctgacaccgatccgctgccagtcgtcttccccattgtgcaaggt420gaactgagcaagcagaccggacaacaggtatcgatagcgceg462<210〉8<211〉154<212>PRT<213>结核杆菌<400〉8ProLysThrTyrCvsGluGluLeuLysGlyThrAspThrGlyGinAla151015CvsLeulieGinMetSerAspProAlaTyrAsnThrAsnlieSerLeu202530ProSerTyrTyrProAspGinl>ysSerLeuGluAsnTyrlieAlaGin3^4045ThrArgAspLysPheLeuSerAlaAlaThrSerSerThrProArgGlu50'5560AlaProTyrGluLeuAsnlieThrSerAlaThrTyrGinSerAlalie65707580ProProArgGlvThrGinAlaValValLeuLysValTyrGinAsnAla859095GlyGlyThrHisProThrThrThrTyrLysAlaPheAspTrpAspGin100105110AlaTyrArgLysProlieThrTvrAspThrLeuTrpGinAlaAspThr1151^0125AspProLeuProValValPheProlieValGinGlyGluLeuSerLvs13013514i)GinThrGlyGinGinValSerlieAlaPro145150〈210〉9〈211〉90〈212〉DNA<213>结核杆菌<400〉9accagccccacatcctgggaacaggcggcggcggaggcggtccagcgggcgegggatagegtcgatgacatccgcgtcgctegggtcatt6090<210〉10〈211>30<212>PRT〈213>结核杆菌〈400〉10ThrSerProThrSerTrpGluGinAlaAlaAlaGluAlaValGinArg151015AlaArgAspSerVa.lAspAsplieArgValAlaArgVallie202530<210〉11<211〉192<212〉腿〈213〉结核杆菌〈400〉11gccggggtcgcctccgcagatcccgtggacgcggtcattaacaccacctgcaattacggg60C3ggtagt.eigctgcgctcaacgcgacggatccgggggctgccgcacagttcaacgcctca120ccggtggcgcagtcctatt.tgcgcaattt.cctcgccgcaccgc.cacctcagcgcgctgcc1803tggCCgCgC朋192<210>12<211〉64<212〉PRT〈213〉结核杆菌<400>12AlaGlyVal1AlaSerAlaAspProValAspAla510VallieAsnThrThr15CysAsnTyrGlyGinValValAlaAlaLeuAsn2025AlaThrAspProGly30AlaAlaAla35.GinPheAsnAlaSerProValAla40GinSerTyrLeuArg45'AsnPheLeu50AlaAlsProProProGinArgAls55AlaMetAlaAlaGin60〈210〉13〈211〉429<212〉腿〈213〉结核杆菌<400>13gcggacaagacgacacagacgatttacatcgacgcggatcc3ggcg3ggtgatg犯ggcg60atcgccgacatcgaagcctacccgcaatggatttcggagtataaggaagtcgagatccta120g鄉ccgacgacgagggctacccgaaacgagcgcgaatgttgatggacgcagccatcttc180aaagacacct,tgatcatgtcc.tacgagtggccggaagaccgccaatcgcttagctggact240ctcgaatccagctcgctgctaaagtccctcgaaggcacgtatcgcttggcgcccaagggt.300tctggcactgaggtcacct.acgagcttgccgtcgaccttgctgtccccatgatcgggatg360ct.caagcgtaaggcggaacgcaggttgatagacggcgcgttgaaggatctg犯gaaacga420gtc.gagggc429〈210〉14<211>143<212〉PRT<213〉结核杆菌〈400〉14AlaAspLysThrThrGinThrlieTyrlieAsp1510AlaAspProGlyGlu15ValMetLysAlalieAlaAsplieGluAlaTvr2025ProGinTrplieSer30GluTyrLysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGluGlvTvrPro'354045LysArgAlaArgMetLeuMetAspAlaAlaliePheLysAspThrLeu505560lieMetSerTvrGluTrpProGluAspArgGinSerI>euSerTrpThr65707580LeuGluSerSerSerLeuLeuLysSerLeuGluGlv丁hrTyrArgLeu8590'95AlaProLysGlySerGlyThrGluValThrTyrGluLeuAlaValAsp100105110LeuAlaValProMetlieGlyMetLeuLvsArgLysAlaGluArgArg115120125LeulieAspGlyAlaLeuLysAspLeuLvsLysArgValGluGly130l!35140<210〉15〈211〉1356<212>DNA〈213〉人丁序列<400〉15gc.ggcgggctgtggctcg犯accaccgagcggttcgcct.gaaacgggcgccggcgccggt60actgtcgcgactacccccgcgtcgtcgccggtgacgttggcggagaccggtagcacgctg120ctctacccgctgttcaacctgt.ggggtccggCCtttC3Cgagaggtatccgaacgtcacg180atcaccgctcagggcaccggt.tctggtgccgggatcgcgcaggccgccgccgggacggt.c240赢3ttggggcctccgacgcctatctgtcggaaggtgatat.ggccgcgcac犯ggggctg300atgaacatcgcgctagccatctccgctca.gcaggtcaact.acaacctgcccggagtg郎c360gagcacctcaagctgaacgg犯aagtcctggcggccatgt3CC3gggC3CC3tC朋33CC420tgggacgacccgcagatcgctgcgctcaacCCCggCgtg3acctgcccggcaccgcggta480gttccgctgcaccgctccgacgggtccggtgacaccttcttgttcacccagtacctgtcc540aa.gcaagatcccgagggctggggc卿tcgcccggcttcggC3CC3CCgtagact.tcccg600gcggtgccgggtgcgctgggtgag纖ggc紛cggcggcatggtgaccggttgcgccgag6603C3CCgggC"tgcgtggcctatatcggcatcagcttcctcgaccaggccagtcaacgggga720ctcggcgaggcccaactaggcaatagctctggcaatttcttgttgcccgacgcgc犯agc7803ttcaggccgcggcggctggCttCgC3tCgaaaaccccggcgaaccaggcgat.Ucgatg8403tCg3CgggCccgccccggacggctacccgatcat.caactacgagt3cgccatcgtcaac900aa.ccggcaaaaggacgccgccaccgcgcagaccttgcaggcatttctgcactgggcgatc960accgacggcaacaaggcctcgttcctcgaccaggttcatttccagccgctgccgcccgcg1020gtggtgaagttgtctgacgcgttg已tcgcgacgatttccagctctggtggcggtagtagc1080ggcggcggtagccattccctccttgacgagggg朋gc;agtccctgaccaagctcgcagcg1140gcctggggcggtagcggttcggaggcgtacc娜gtgtccagcaaaaatgggacgccacg1200gctaccgagctga織gtggcggtggctcttccggtggtggctctgaagcagcc貼t朋g1260cagaagcaggaactcgacgagatctcgacgaatat.tcgtcaggccggcgtccaatactcg1320agggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcg1356〈210〉16<211〉452<212>PRT<213〉人T.序列〈400〉16Ala.AlaGlvCysGlvSerLysProProSerGlySerProGluThrG1y1:51015AlaGlvAlaGlyThrValAlaThrThrProAlaSerSerProValThr202530LeuAlaGluThrGlySerThrLeuLeuTyrProLeuPheAsnLeuTrp354045GlyProAlaPheHisGluArgTyrProAsnValThrlieThrAlaGin505560GlyThi'GlySerGlyAlaGlylieAlaGinAlaAlaAlaGlyThrVal65707580AsnlieGlvAlaSerAspAlaTvrLeuSerGluGlyAspMetAlaAla859095HisLysGlyLeuMetAsnlieAlaLeuAlalieSerAlaGinGinVal100105110AsnTyrAsnLeuProGlyValSerGluHisLeuLysLeuAsnGlyLys'115.120125ValLeuAlaAlaMetTyrGinGlvThrlieLysThrTrpAspAspPro130135M0GinlieAlaAla.LeuAsnProGlyValAsnLeuProGlyThrAlaVal145150155160ValProLeuHisArgSerAspGlvSerGlyAspThrPheLeuPheThr165170175GinTyrLeuSerUsGinAspProGluGlyTrpGlyUsSerProGly180185190PheGlyThrThrValAspPheProAlaValProGlyAlaGlyGlu195200205AsnGlvAsnGlvGlyMetValThrGlyCysAlaGluThrProGlvCys210215220ValAlaTyrlieGlvlieSerPheLeuAspGinAlaSerGinArgGly225230235240LeuGlyGluAlaGinLeuGlvAsnSerSerGlyAsnPheLeuLeuPro'245250255AspAlaGinSerlieGinAlaAlaAlaAlaGlyPheAlaSerLysThr260265270ProAlaAsnGinAlalieSerMetlieAspGlyProAlaProAspGly275280285TyrProlielieAsnTyrGlu丁yrAlalieValAsnAsnAi'gGinLys290295300AspAlaAla丁hrAlaGinThrLeuGinAlaPheLeuHisTrpAlalie305310315320ThrAspGlyAsnLysAlaSerPheLeuAs卩GinValHisPheGinPro325330335LeuProProAlaValValL>vsLeuSerAspAlaLeulieAlaThrlie340345350SerSerSerGlvGlyGlySerSerGlyGlyGlySerHisSerLeuLeu355360365AspGluGlvLvsGinSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrpGlvGly370375380SerGlySerGluAlaTyrGinGlyV'aiGinGin乙ysTrpAspAlaThr3853^0395400AlaThrGluLeuAsnSerGlyGlyGlySerSerGlvGlyGlvSerGlu405410'415AlaAlaAsnLysGinLysGinGluLeuAspGlulieSerThrAsnlie4^0425430Ai'gGinAlaGlvValGinTyrSerArgAlaAspGluGluGinGinGin435440445AlaLeuSerSer450<210〉17<211>1263<212>DNA<213>人工序列<400〉17ccggggtcgcctccgcagatcccgtggacgCggtC3tt犯caccacctgcaattacgggc60aggtagtagctgcgctcaacgcga.cggatccgggggctgccgcacagttcaacgcctcac120cggtggcgcagtcctatttgcgcaatt.t.cctcgccgcaccgccacctcagcgcgctgcca180tggccgcgcaat.ccggcggtggtagctctggtggcggctcccccaagacctactgcg鄉240服ttg雄ggcaccgataccggccaggcgtgcctgattcaaatgtccgacccggcctaca300acacc犯c8tcagcctgcccagttactaccccgaccagaagtcgctgg犯aattacatcg360cccagacgcgcgacaagtt.cctcagcgcggcaacatcgtccactccacgcgaagccccct420acgaattg犯tatcacctcggccacataccagtccgcgataccaccgcgtggtacgcagg480ccgtggtgctcaaggtctaccagaatgccggcggcacgcacccaacgsccacgtacaagg540ccttcgatt.gggaccaggcttatcgcaagccaatcacctatgacacgctgtggcaggctg600acaccgatccgctgccagtcgtcttccccattgtgcaaggtgaactgagcaagcagaccg660gacaacaggtatcgatagcgccgtctggtggcggtagtag.cggcggcggtagcgcggaca720agacgacacagacgatttacatcgacgcggatccaggcgaggtgat.gaaggcgatcgccg780acatcgaagcctacccgcaatggatttcggagtataagga.agtcgagatcctagaggccg840acgacgagggctacccgaaacgagcgcgaatgttgatggacgcagccatcttcaaagaca900ccttgatcatgtcctacgagtggccggaagaccgccaatcgcttagctggactctcgaat%0ccagctcgctgctaaagtccctcgaaggcacgtatcgcttggcgcccaagggttctggca1020ctgaggtcacctacgagcttgccgtcgaccttgctgtccccatgatcgggatgctcaagc1080gtaaggcggaacgcaggttg.at卿cggcgcgtt,ggatctacgagtcgagg1140gcagtggcggtggctcttccggt.ggtggctct.gaccagccccacatcctgggaacaggcg1200gcggcggaggcggtccagcgggcgcgggstagcgtcgatgscatccgcgtcgctcgggtc1260att1263<210>18<211>421<212>PRT<213>人丁.序列<400〉18AlaGlyValAlaSerAlaAspProValAspAlaVallieAsnThrThrCvsAsnTyrGlyGinValValAlaAlaLeuAsnAlaThrAspProGly202530AlaAlaAlaGinPheAsnAlaSerProValAlaGinSerTyrLeuArg354045AsnPheLeuAlaAlaProProProGinArgAlaAlaMetAlaAlaGin505560SerGlvGlyGlySerSerG1yGlyGlvSerProLvsThrTvrCysGlu65'.707580GluLeuLysGlyThrAspThrGlyGinAlaCysLeulieGinMetSer859095AspProAlaTyrAsnThrAsnlieSerLeuProSerTyrTyrProAsp100105110GinLysSerLeuGluAsnTvrlieAlaGinThrArgAspLysPheLeu115120125SerAlaAlaThrSerSerThrProArgGluAlaProTyrGluLeuAsn130135140lieThrSerAlaThrTvrGinSerAlalieProProArgGlyThrGin145150155160AlaValValLysValTyrGinAsnAlaGlyGlyThrHisProThr165170175丁hrThrTyrLysAlaPheAspTrpAspGinAlaTyrArglysProlie180185190ThrTyrAspThrLeuTrpGinAla.AspThrAspProLeuProValVal'195200205PheProlieValGinGlyGluLeuSerLysGinThrGlyGinGinVal210215220SerlieAlaProSerGlyGlyGlySerSerGlyGlvGlySerAlaAsp225230235240LysThrThrGinThrlieTyrlieAspAlaAspProGlyGluValMet245250255LvsAlalieAlaAsplieGluAlaTyrProGinTrplieSerGluTvr260265270LysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGluGlyTyrProLvsArg275280285AlaArgMetLeuMetAspAlaAlaliePheLvsAspThrLeulieMet290295300SerTyrGluTrpProGluAspArgGinSerLeuSerTrpThrLeuGlu305'310315320SerSerSerLeuLeuLvsSerLeuGluGlvThrTyrArgLeuAlaPro325330335LysGlySerGlyThrGluValThrTyrGluLeuAlaValAspLeuAla'—340345350ValProMetlieGlvMetLeuLvsArgLvsAlaGluArgArgLeulie355360365AspGlvAlaLeuLysAspLeuLvsLysArgValGluGlySerGlvGly37b375380GlySerSerGlyGlyGlySerThrSerProThrSerTrpGluGinAla385390395400AlaAlaGluAlaValGinArgAlaArgAspSerValAspAsplieArg405410415ValAlaArgVallie420权利要求1.用于血清学诊断结核病的组合物，其包含结核杆菌Mtb16.3的特异表位抗原肽段与选自38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种结核杆菌特异表位抗原肽段的组合；其中Mtb16.3特异表位抗原肽段为SEQIDNO14所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，38kD特异表位抗原肽段为SEQIDNO2所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，ESAT-6特异表位抗原肽段为SEQIDNO4所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，CFP10特异表位抗原肽段为SEQIDNO6所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，MPT64特异表位抗原肽段为SEQIDNO8所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。2.权利要求1的组合物，其还含有选自Mtb8和Mtb8.4的至少一种结核杆菌特异表位抗原肽段；其中Mtb8特异表位抗原肽段为SEQIDNO:10所示氨基酸序列的多肽或其功能变体，Mtb8.4特异表位抗原肽段为SEQIDNO:12所示氨基酸序列的多肽或其功能变体。3.权利要求1或2所述的组合物，其中在组合物中各个特异表位抗原肽段单独存在。4.权利要求1或2所述的组合物，其中在组合物中一些特异表位抗原肽段以融合蛋白质的形式存在。5.权利要求1或2所述的组合物，其中在组合物中38kD、ESAT6和CFP10特异表位抗原肽段以一个融合蛋白质的形式存在，MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特异表位抗原肽段以另一个融合蛋白质的形式存在。6.权利要求5所述的组合物，其中一个融合蛋白质从N末端至C末端依次为38kD、ESAT6和CFP10特异表位抗原肽段，另一个融合蛋白质从N末端至C末端依次为Mtb8.4、MPT64、Mtbl6.3和Mtb8特异表位抗原肽段。全文摘要本发明涉及用于血清学诊断结核病的组合物，其包含结核杆菌Mtb16.3的特异表位抗原肽段与选自38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一种结核杆菌特异表位抗原肽段的组合。文档编号G01N33/569GK101477125SQ20081000002公开日2009年7月8日申请日期2008年1月3日优先权日2008年1月3日发明者冯晓燕,宋晓国,张贺秋,王国华,坤陈申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所;上海荣盛生物药业有限公司