人pkm2抗原决定簇多肽、抗体及其在检测试剂盒上的应用

人pkm2抗原决定簇多肽、抗体及其在检测试剂盒上的应用
【专利摘要】本发明为一种人PKM2抗原决定簇多肽、抗体及其在诊断试剂盒上的应用。本发明的PKM2抗原决定簇多肽，为正文陈述的多肽片段SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明的PKM2抗体，是由本发明的PKM2抗原决定簇多肽制备而成。本发明的PKM2抗体可应用于制备PKM2体外诊断试剂盒。
【专利说明】
人PKM2抗原决定簇多肽、抗体及其在检测试剂盒上的应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及人PKM2抗原决定簇多肽、抗体及其在 检测试剂盒上的应用。
[0003]
【背景技术】
[0004] 丙酮酸激酶催化磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸并产生一个ATP分子，是葡萄糖 形成丙酮酸即糖酵解代谢最后一步反应的催化刹，也是糖酵解的限速酶之一。ATP、长链脂 肪酸、乙酰-CoA、丙氨酸都对该酶有抑制作用；而果糖-1，6-二磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸对 该酶与都有激活作用。
[0005] 丙酮酸激酶有四种同工酶--Ml、M2、L和R型，在正常细胞中，它们主要以四聚体 形式存在。丙酮酸激酶的表达有组织特异性，主要取决于细胞和组织的代谢情况。Ml型丙酮 酸激酶表达于能量消耗快速耗氧量大的组织，如肌肉和脑;L型丙酮酸激酶主要表达在糖异 生旺盛的组织，如肝脏和肾脏;R型丙酮酸激酶主要在红细胞中表达;而M2型丙酮酸激酶主 要在干细胞和胚胎细胞等快速增殖的细胞中特异表达。丙酮酸激酶L型和R型由相同的基因 编码，但它们的表达由不同的启动子控制。丙酮酸激酶Ml型和M2型则是Μ基因转录的同一 mRNA的不同剪切产物，它们之间只有21个氨基酸的差别。
[0006] 研究发现:肿瘤的发生往往伴随着肿瘤部位丙酮酸激酶同工酶类别的转换。因为 相比于ATP的合成，肿瘤细胞生物大分子的合成更加旺盛;为维持其自身的快速增殖，肿瘤 细胞需要大量的糖代谢中间产物，比如3-磷酸甘油酸来用于氨基酸、磷脂的合成。因此，月中 瘤发生往往表现为其来源的正常组织特异性丙酮酸激酶的变化，比如脑组织中PKM1，肝脏 中PKL消失，而PKM2大量表达。
[0007] 在正常细胞中，PKM2主要以四聚体形式存在，然而在肿瘤细胞和组织中PKM2主要 以二聚体形式存在。这两种存在形式的区别在于：四聚体形式下的PKM2与其底物磷酸烯醇 式丙酮酸(PEP)有很高的亲和力，而二聚体形式下PKM2与PEP亲和力却很低，这意味着四聚 体的PKM2有很高的活性而PKM2二聚体则几乎无活性。肿瘤中主要以二聚体形式存在导致了 肿瘤细胞内糖代谢中间体的高浓度，对肿瘤细胞的增殖具有重要的作用。肿瘤细胞内PKM2 四聚体与二聚体的比例受细胞内1，6_二磷酸果糖浓度的调节而上下波动。1，6_二磷酸果糖 是糖代谢的中间产物，由于肿瘤细胞PKM2的高度二聚体化，1，6-二磷酸果糖等中间产物无 法进一步往下游产物转化，导致了 1，6_二磷酸果糖的高浓度。而当1，6_二磷酸果糖浓度高 到一定值时，抑制型二聚体将结合1，6_二磷酸果糖导致构形转变，重新聚合形成四聚体，使 PEP催化生成丙酮酸，进而进入三羧酸循环供给能量。当1，6_二磷酸果糖浓度下降到最低值 时，聚合的四聚体又将转化变成二聚体。肿瘤细胞PKM2的这种激活型四聚体和抑制型二聚 体的相互转化在肿瘤适应环境不断改变的氧含量和营养条件中起着至关重要的作用，强大 的糖代谢能力和PKM2的存在使肿瘤细胞能在低氧环境下生长并转移。
[0008] 多项研究已证实，肿瘤发生过程中PKM2通过调节糖代谢而影响肿瘤细胞的增殖和 转移。用肌肉组织特异的Ml型丙酸激酶取代M2型丙酮酸激酶，降低了胖瘤细胞糖酵解代谢 的速率，减少了小鼠成瘤的几率和瘤块的体积;用抑制剂抑制M2型丙酮酸激酶的活性，也能 降低糖酵解代谢的速率，抑制肿瘤细胞的生长，甚至杀伤种瘤细胞。
[0009] 在肿瘤发生过程中，由于肿瘤细胞的坏死和转移，肿瘤细胞中的PKM2能释放进入 血液、尿液中，而消化道肿瘤的PKM2亦能随着肿瘤患者的粪便排出。此外，由于在正常状况 下PKM2-般很难被检测到，只有在发生肿瘤时PKM2才能从坏死的肿瘤细胞中释放入血、尿， 因此检测PKM2的量还可评估化疗效果的好坏以及肿瘤预后的判断。因此，检测PKM2可以用 于肿瘤诊断、抗肿瘤疗效评价和预后判断。
[0010]检测PKM2较理想的方法即是免疫测定，但前提是必须制备针对PKM2的特异性抗 体，而M2型丙酮酸激酶与其他同工酶差别较小。制备特异识别PKM2而不结合其他丙酮酸激 酶同工酶的抗体就成为研究的关键。
[0011]

【发明内容】

[0012] 本发明的目的在于提供一种针对离体组织或体液或尿液PKM2水平，提供具有亲 水、抗原性强、易于合成、特异性强的免疫源性的人PKM2抗原决定簇多肽，其为如下两种多 肽片段之一， (1) Leu-Ala-Pr〇-Ile-Thr-Ser-Asp-Pr〇-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala(SEQ ID NO·1)，即 LAPITSDPTEATAVGA; (2) Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu-Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys(SEQ ID NO.2)，即ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK〇
[0013] 采用的优化措施包括： 上述 1^11-厶1&-?1'〇-116-1111-361-厶8卩-?1'〇-1'111-6111-厶1&-1'111-厶1&-\^1-617-厶1&的1^端 或C端还具有Tyr。
[0014] 上述 Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu- 4811-116-1^11-1'印-1^11-厶8口-171-1^8的1^端或〇端还具有丁5^〇
[0015]本发明的多肽片段SEQ ID NO. 1是人PKM2蛋白C端的一段16个氨基酸的残基，在该 肽段的N端、C端分别加上Tyr则组成多肽片段(3)、多肽片段(4)，如下： (3) Y-LAPITSDPTEATAVGA (4) LAPITSDPTEATAVGA-Y 多肽片段SEQ ID N0.1在N端或C端加 Tyr是为了通过BDB(双偶氮联苯胺二氯化物扮8_ 虹32〇1：丨26此6112丨(1；[116(1；[011101^(16)交联到血兰蛋白（1(1^)上作为抗原制备抗体，171'加在~ 端产生抗多肽C端抗体，Tyr加在C端，产生抗多肽N端抗体。
[0016]本发明的多肽片段SEQ ID N0.2是人PKM2蛋白N端的一段25个氨基酸残基，在该肽 段的N端、C端分别加上Tyr则组成多肽片段(5)、多肽片段(6)，如下： (5) Y-ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK (6) ATLKITLDNAYMEKCDENILWLDYK-Y 多肽片段SEQ ID N0.2在N端或C端加 Tyr是为了通过BDB(Bis_diazotizedbenzidine dichloride)交联到血兰蛋白（KLH)上作为抗原制备抗体，Tyr加在N端产生抗多肽C端抗 体，Tyr加在C端，产生抗多肽N端抗体。
[0017] 本发明的还提供一种特异性强的人PKM2抗体，由SEQIDN0.1或SEQIDN0.2任意 一种多肽片段制备而成的多克隆抗体或单克隆抗体，即提供能与人PKM2抗原决定簇多肽特 异性结合的抗体。
[0018] 本发明的还提供一种人PKM2抗体在制备人PKM2体外检测诊断试剂盒上的应用。 [0019]进一步的优化措施包括:上述剂盒采用SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0.2制备的任意一 种人PKM2抗体作为包被抗体。
[0020] 上述试剂盒还包括结合抗体，结合抗体为另一种人PKM2抗体，与包被抗体的多肽 来源不同。
[0021] 上述试剂盒还包括酶标记的二抗。
[0022] 上述两种多肽片段具有如下功能： ①具有免疫原性，且具有亲水、抗原性强、易于合成。
[0023] ②与载体蛋白连接后作为抗原可刺激动物产生特异性的抗体。
[0024] ③用这两种多肽片段制备的抗体可特异性的与人PKM2结合。
[0025]
【具体实施方式】
[0026]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0027] 实施例：将本发明的任意一种PKM2抗原决定簇多肽（SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2) 与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物即可制备本发明的特异性的单克隆抗体或多克隆抗 体。
[0028] 如前所述依次制得PKM2抗原决定簇多肽片段和其特异性抗体后，即可将该抗体用 于制备人PKM2体外诊断试剂盒。将采用本发明的抗体制备的人PKM2体外诊断试剂盒进行临 床研究，在137例结直肠癌患者中，123例血清PKM2超过10U/ml，而正常受试者中对照平均 值为2 U/ml，二者比较p<0.001。若以2.5U/ml为划定标准，血清PKM2辅助诊断结直肠癌患 者的特异性为极高，灵敏度90%~95%。同时，通过对24例结直肠癌患者追踪研究发现:血清 PKM2水平与直肠癌患者严重程度呈正相关;血清PKM2水平高，患者预后效果较差。说明血清 PKM2作为一种辅助诊断直肠癌的生化标记物是切实可行性，也揭示了血清PKM2水平在出血 后判断直肠癌的程度及患者的预后具有重要的临床意义。同时说明本发明的多肽片段抗原 性强，制备的抗体特异性强。
[0029] 将PKM2抗原决定簇多肽片段与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物制备特异性的 单克隆抗体。
[0030] ①抗原的制备：用碳二亚胺法将PKM2多肽片段(3)或(4)与载体血兰蛋白（KLH)联 接制备成PKM2抗原(3)或(4)。
[0031] ②免疫动物：取上述制备的抗原与弗氏完全佐剂（基础免疫）或弗氏完不全佐剂 (加强免疫)等体积混合，充分乳化后免疫Balb/c小鼠，腹腔注射，每次剂量为200ug/ml，免 疫4~5次，末次免疫后的第四天取尾静脉血测定抗体效价。
[0032]③测定抗体效价：用ELISA法测定抗体效价，结果显示抗体效价达到1:30000以 上。
[0033]④杂交瘤细胞筛选:免疫动物抗体效价符合要求后，取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤 细胞按常规方法用50%PEG(分子量4000)介导进行融合，并用HAT条件培养基选择培养。融合 后放入C02培养箱中37°C培养9~11天后，孔内出现较大的细胞克隆。11天开始用间接 ELISA进行筛选。对阳性的孔利用有限稀释法进行4次克隆化培养，之后扩增细胞、冻存、制 备腹水。
[0034]⑤腹水制备:将Balb/c小鼠用降植烷0.5ml/只处理，一周后腹腔接种杂交瘤细胞2 Χ?ο6个/只，十天后收集腹水。
[0035]⑥测定单克隆抗体效价:用间接ELISA测定PKM2抗原制备的单克隆抗体效价，结果 显示单抗的效价达到1:30000以上。
[0036]将PKM2抗原决定簇多肽片段与载体蛋白连接后作为抗原免疫动物制备特异性的 多克隆抗体。
[0037]①抗原的制备：用碳二亚胺法将PKM2多肽片段(5)或(6)与载体血兰蛋白（KLH)联 接制备成PKM2抗原(5)或(6)。
[0038]②免疫动物：取上述制备的抗原与弗氏完全佐剂（基础免疫）或弗氏完不全佐剂 (加强免疫)等体积混合，充分乳化后免疫新西兰大白兔背部，每次剂量为200ug/ml，分20点 皮内注射，免疫4~5次，末次免疫后的第四天取耳血测定抗体效价。
[0039]③测定抗体效价：用ELISA法测定抗体效价，结果显示抗体效价达到1:30000以 上。
[0040]④取血及分离血清:颈动脉插管取血，分离血清。
[0041] ⑤分离纯化抗体:硫酸铵沉淀后，再经Protein G亲和纯化。
[0042]⑥抗体分装后冻干，低温保存。
[0043] 人PKM2单克隆抗体和多克隆抗体的特异性鉴定 以ELISA进行检测。分别以人PKM2蛋白、BSA、S-100B蛋白、神经元特异性烯醇化酶NSE为 检测抗原包被EL ISA板，通过EL ISA分别检测所制备的PKM2单克隆抗体或多克隆抗体与人 PKM2蛋白的特异性反应，以正常Balb/c小鼠血清或新西兰大白兔血清作阴性对照，PBS液作 空白对照。结果:所有PKM2单克隆抗体和多克隆抗体分别只与PKM2反应为阳性，而与其他蛋 白反应为阴性，说明本发明所有PKM2单克隆抗体和多克隆抗体具有特异性。
[0044] 利用人PKM2单克隆和多克隆抗体制备PKM2体外诊断试剂盒 在本例实施中，将利用PKM2抗原决定簇多肽(1)制备的单克隆抗体(1)作为本试剂盒中 的包被抗体;将利用PKM2抗原决定簇多肽(2)制备的多克隆抗体(2)作为本试剂盒中的结合 抗体； PKM2体外诊断试剂盒的制备和操作如下： ①各种缓冲液及试剂的配制 A包被缓冲液:0.05M、pH9.6的碳酸盐缓冲液 Na2C03:16.0克 NaHC03:29·0克 NaCl:10克 蒸馏水溶至1000ml B样品稀释液/洗涤缓冲液:pH7 · 2的10 X roS-Tween20 Na2HP〇4-12H2〇:58 克 KH2P〇4:4克 NaCl:100克 KC1:4克 蒸馏水溶至l〇〇〇ml 加 Tween20:20ml C酶标记物稀释液： 10 X PBS-Tween20：10ml 小牛血清(FCS): 20ml 蒸馏水溶至l〇〇〇ml 酶稳定剂:1克 生物防腐剂：1ml D显色剂甲： 梓檬酸:35.5克 过氧化脲:10克 蒸馏水溶至l〇〇〇ml 加 Tween20:10ml E显色剂乙： 柠檬酸：120克 EDTA-2Na:l克 TMB-2HC1:2克 蒸馏水溶至l〇〇〇ml F终止液:2M H2SO4 浓硫酸（95 ~98%) :22.2ml 蒸馏水：177.3ml 配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。
[0045] ②预包被板的制备： 将PKM2单克隆抗体（1)溶于pH=9.6的0.05M的碳酸盐缓冲液中，单抗浓度为5ug/ml，制 成预包被液，在酶标板上每孔加入l〇〇ul，置4°C放置18~24小时，取出，甩掉包被液，洗涤， 经BSA室温封闭1小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4°C保存。
[0046] ③结合抗体（即PKM2抗原决定簇多肽片段(2)制备的多克隆抗体）和辣根过氧化 物酶标羊抗兔二抗浓度确定:结合抗体和酶标二抗浓度用方阵滴定实验确定。
[0047]④试剂盒的组成： A:预包被板:48/96孔 B:人PKM2标准品：7 X 1 · 0ml (浓度分别为：50U/ml、25U/ml、10U/ml、5U/ml、2 · 5U/ml、1U/ ml、0.5U/ml) C: PKM2 结合抗体：1 X 1 · 0ml (浓度:0 · 5mg/ml) D:酶标二抗(HRP-IgG): 1 X 10ml (经1:5000稀释） E:浓缩洗涤液（10 X PBS-Tween20): 1 X 100ml F:样品稀释液：1 X 10ml G:显色剂甲：lX6.0ml Η:显色剂乙：lX6.0ml I:终止液：lX6.0ml ⑤试剂盒的操作步骤： 在预包被板的各孔中分别加入待检血样标本以及标准品l〇〇ul/孔，均为双孔，同时设 空白孔，37°C孵育60分钟，用X 1洗涤液(PBS-TWeen20)洗涤5次，拍干。在各孔内加入结合 抗体（g卩PKM2抗原决定簇多肽片段（1)多克隆抗体）100ul/孔，37°C孵育30分钟，用XI洗 涤液(PBS-T Ween20)洗涤5次，拍干。再在各孔内加入标记有辣根过氧化酶的羊抗兔IgG抗 体100ul/孔，37°C孵育30分钟，用XI洗涤液(PBS-T Ween20)洗涤5次，拍干。加入显色剂 甲、乙液每孔各50ul，混匀，37 °C孵育15分钟。加终止液50 ul/孔终止反应，用酶联检测仪 测定各孔的450nm处的吸光度。
[0048]⑥结果判定： 0D比值计算:待测标本孔的0D值-空白孔的0D值 表一:标准品浓度和对应的平均吸光度(0D )值
以标准品浓度和对应的平均吸光度值绘制标准曲线，标准曲线的R2=0.986 通过标准曲线计算所检测的样本中的PKM2浓度结果。
[0049] 试剂盒可以特异性检测出人PKM2蛋白，而不识别人PKM1蛋白和人PKML蛋白。
[0050] 血清中137例出血性脑卒中患者病人中，123例血清PKM2超过10U/ml，而正常受 试者中对照平均值为2 U/ml，二者比较p<0.001。若以2.5U/ml为划定标准，血清PKM2诊断 结直肠癌患者的特异性为98%，灵敏度90%~95%。
[0051] 尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域 技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改 变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是:为如下两种多肽片段之一， DLeu-Ala-Pro-IIe-Thr-Ser-Asp-Pro-Thr-Glu-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Ala； 2)Ala-Thr-Leu-Lys-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu- Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Lys 〇2. 根据权利要求1所述的人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是:所述的!^!!^]^-?!^-]：]^-111!-361-厶8卩-?1'〇-1'111-6111-厶1&-1'111-厶1&-\^1-617-厶1&的1^端或〇端还具有丁5^ 〇3. 根据权利要求1所述的人PKM2抗原决定簇多肽，其特征是:所述的4]^-1111-1^11-1^8-Ile-Thr-Leu-Asp-Asn-Ala-Tyr-Met-Glu-Lys-Cys-Asp-Glu-Asn-Ile-Leu-Trp-Leu-Asp-Tyr-Ly s的N端或C端还具有Tyr 〇4. 人PKM2抗体，其特征是：由权利要求1所述的任意一种多肽片段制备而成的多克隆抗 体或单克隆抗体。5. 根据权利要求4制备的人PKM2抗体在制备人PKM2体外检测诊断试剂盒上的应用。6. 根据权利要求5制备的人PKM2抗体在制备人PKM2体外检测诊断试剂盒上的应用，其 特征是:所述试剂盒采用权利要求4所述的任意一种人PKM2抗体作为包被抗体。7. 根据权利要求6制备的人PKM2抗体在制备人PKM2体外检测诊断试剂盒上的应用，其 特征是:所述的试剂盒还包括结合抗体，结合抗体为权利要求4所述的另一种人PKM2抗体， 与包被抗体的多肽来源不同。8. 根据权利要求7制备的人PKM2抗体在制备人PKM2体外检测诊断试剂盒上的应用，其 特征是:所述的试剂盒还包括酶标记的二抗。
【文档编号】G01N33/573GK105886483SQ201610120995
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月3日
【发明人】陶新博, 张守涛, 郭亚楠
【申请人】浙江聚康生物工程有限公司