毛线虫属的抗原性多肽及其用途的制作方法

专利名称：毛线虫属的抗原性多肽及其用途的制作方法
毛线虫属的抗原性多肽及其用途本发明涉及在毛线虫属(Trichinella)寄生虫中鉴定的新型抗原在毛线虫病(Trichinosis)的诊断和预防中的用途。毛线虫病是与食用感染有毛线虫属寄生虫的肉类相关的人畜共患病(zoonosis)(MURRELL et al. , Vet ParasitoI, 93, 293-307，2000)。这种线虫属于有腺纲(Adenophorea)，毛线虫科。毛线虫科包括具有亲缘关系的八个种和三个基因型，并在系统发育上被分为不同的两组一组为感染哺乳动物的有包囊毛线虫(旋毛形线虫(T. spiralis)、北方毛形线虫(T. nativa)、布氏毛形线虫(T. britovi)、米氏毛形线虫(T. murrelli)、南方毛形线虫(T. nelsoni));另一组为感染哺乳动物、鸟类以及爬行动物的没有包囊的毛线虫(伪毛形线虫(T. pseudospirali)、巴布亚毛形线虫(T. papuae)、津巴布韦毛形线虫(T. zimbabwensis)) (GASSER et al. , Electrophoresis, 25,3357-64, 2004) 这些种类全部可以感染人体。 这种寄生虫的生物周期属于自异宿主型，即整个生物周期都发生于同一宿主体内，此宿主既为中间宿主，又是终宿主(B0IREAU et al.，Revue frail Cai SCdeslaboratoires, 71-89, 2002)。为了开始新一轮的周期,侵染性幼虫需要从一个宿主传递到另外一个宿主。这种传递是通过摄取被寄生虫幼虫污染的生肉或几乎不经烹调的肉而实现的。消化过程中，所述幼虫被释放出来，穿透肠道上皮，并在此转变为有生殖能力的成虫(Ad)。接下来，受精的雌虫排出新生的LI幼虫(NBL)。这些NBL幼虫通过淋巴循环和血流到达横纹肌，并穿透肌肉细胞(感染发展阶段LlM L1肌肉幼虫)，引起肌肉细胞的去分化，形成被保护性胶原蛋白被膜包围的滋养细胞，其中，在有包囊的毛线虫情况下形成的被膜较厚，而无包囊的毛线虫的被膜很薄。虽然毛线虫病在动物中是没有临床症状的，但是在人体感染中，肠道寄生阶段的表现为伴有恶心的腹泻、呕吐和剧烈的腹痛，而肌肉侵入阶段相关症状为发热、面部浮肿及肌痛的综合症状(CAPO & DESPOMMIERjClin Microbiol Rev, 9，47-54，1996)。眼、肺、胃肠、心脏以及神经的发病可以产生更多的临床表现，其发展是可以致命的。以病人持久的肌肉疼痛为标志的慢性感染特性与寄生虫在滋养细胞中存活有关。如果对于感染的诊断及时，从而得以针对所有寄生环节采取措施，特别是在LlM幼虫周围形成胶原蛋白保护被膜之前，这样使用抗蠕虫药专门治疗人毛线虫病会更加有效(FOURESTIE et al. , Parasitol Res, 75, 36-41，1988)。流行病学数据表明了该寄生虫在世界各地的地理分布，并与其传播方式相关，所述传播方式涉及到了许多野生动物群物种，所述野生动物群物种还保留了以猪为主要代表的家畜感染周期(DUPOUY-CAMET, Vet Parasitol, 93，191-200，2000)。由于对饮食习惯及卫生控制的不力，人毛线虫病，这种新兴或再度出现的人畜共患病，其流行构成了全世界严峻的公共卫生问题(MURRELL & Ρ0ΖΙ0, IntJParasitol, 30, 1339-49, 2000) 这些流行主要关系到猪肉、野猪肉及马肉(B0IREAU etal. , Vet Parasitol, 93, 309-20，2000)。因此，预防人类感染就涉及到把肉完全煮熟和改善动物饲养条件和/或改进用于控制动物(猪、马、野猪和其它对毛线虫属敏感的野生动物)毛线虫病的条件(BOIREAU etal. , Revue fran^aise des Iaboratoires, 71-89，2002)。毛线虫病的筛选技术可分为两大类1)人工消化肌肉样本后直接检测LlM幼虫，和2)用各种免疫学方法间接检测针对毛线虫属抗原的抗体。该寄生虫的每个发育阶段，即成虫(Ab)、LI幼虫(NBL)、及LI肌肉幼虫(LlM)，都有与之相对应的特定抗原谱。现阶段用于免疫诊断的抗原制品源自LlM阶段幼虫。这是由于两个早期阶段Ad和NBL的抗原性级分难于纯化，并且直到近期，才鉴定了和这两个阶段中一者和/或另一者相关联的免疫显性抗原(LIU et al.，1-13, 2007)。不论是通过裂解幼虫、离心裂解物和回收上清得到的总可溶性抗原制品，还是更普遍的排泄/分泌抗原(E/S抗原)，都被广泛使用。 当LlM幼虫被放置在具备存活条件的培养基中时产生E/S抗原；其来自所谓杆状体的特定器官。这个器官由约50个圆盘状的杆状细胞组成。这些杆状细胞内含有颗粒，颗粒的内容物通过微管排到寄生虫的食道腔中。该内容物具有极高的抗原性，构成了 E/S抗原的一部分。这些抗原形成了复杂的蛋白质混合物，其中特别包括一组带有特异碳水化合物分子的糖蛋白(称作TSL-I抗原)，其中，该碳水化合物为β-泰威糖(beta-tyvelose),据知只存在于毛线虫属中，并且存在于该类寄生虫的所有种中。现阶段用作毛线虫病免疫诊断参考的E/S抗原制品得自于旋毛形线虫LlM幼虫的培养基。培养18至20小时后，通过过滤回收培养基，而后将其浓缩(GAMBLE et al. , VetParasitol, 13, 349-61, 1983;GAMBLE et al. , Vet Parasitol, 30, 131-7, 1988)。总可溶性抗原制品的主要缺点是其缺少特异性，普遍呈现与其它寄生虫的抗原交叉反应。使用E/S抗原则可获得更好的特异性。然而，在这两种情况下，都难以大量地生产标准化批次的抗原。另一个在毛线虫属血清学诊断中遇到的问题就是对应于早期感染阶段的检测“盲窗期”的存在，其表现为假阴性血清学结果。依初始感染剂量而定，该盲窗期可以持续3到8周。除此之外，在马的体内，从感染开始后的第25周可观察到抗体的逐渐消失。在以往的研究中，本发明团队鉴定了两种在毛线虫属中保守的并且是所述属特异性的免疫显性抗原。在PCT申请WO 2007/090960中有关于这两种抗原的描述。所述抗原之一称为NBLl抗原，在NBL阶段特异表达，而另外一种称为411抗原，则普遍出现于毛线虫属的几个发育阶段。在以纯化重组蛋白形式生产的这些抗原的基础上，开发出了酶联免疫吸附测定(ELISA)类的血清学诊断测定。这些测定允许了抗毛线虫(anti-Trichinella)特异抗体非常早期的血清学检测。与使用E/S抗原的参考酶联免疫吸附测定(E/SELISA测定)相比，在检测是否存在特异性抗毛线虫抗体时，应用了 NBLl和411抗原的ELSA测定比E/S ELISA测定分别早了 5到45天和5到20天。然而，以NBLl抗原为靶的体液应答随后有减弱的倾向(平均感染开始8周后)，并且在检测除北方毛形线虫之外的毛线虫属种类感染时，411抗原较E/S ELISA测定有灵敏度低的缺点。如今，发明人发现了两个新的毛线虫属免疫显性抗原。它们可以被用来开发新型血清学诊断测定，或者用来改进已有测定的性能水平。
在下文中，将所述两种抗原中的第一种称为“L20h_Ts3”。编码此抗原的cDNA克隆序列及由此而推导出的多肽序列在图IA中给出，并分别重现在附带的序列表中，编号为SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2。多肽SEQ ID NO:2与近期鉴定的可能由肌肉入侵阶段的旋毛形线虫幼虫所分泌的蛋白中的SML-3蛋白(GenBank ACJ06741)具有高度的同一性(91%)。SML-3蛋白可能在滋养细胞的形成中发挥作用(⑶ILIANO et al. , Int JParasitol, 39，515-24，2009)，然而它的抗原性质至今还没有被研究过。第二种抗原在下文中被称作“L20h_Tsl”。编码此抗原的cDNA克隆序列及依此推导出的多肽序列在图IB中给出，并且还重现在附带的序列表中，编号为SEQ ID NO: 3和SEQID N0:4。多肽SEQ ID N0:4与毛线虫属或其它生物体中的任何已知蛋白没有任何同一性。以重组形式产生的多肽L20h_Ts3和L20h_Tsl使得早期检测针对毛线虫属的体液应答成为了可能。不仅如此，与感染约8周后就开始减弱的NBLl重组抗原相比，以这些抗原为靶的体液应答在感染后持续更久，所以使用L20h-Ts3和L20h-Tsl多肽使得有可能扩 大体液应答检测的时间窗。因此，本发明的主题是抗毛线虫抗体所识别的抗原性多肽作为用于检测生物样品中抗毛线虫抗体的试剂的用途，其特征在于，所述多肽选自于a)包含SEQ ID NO:2序列的多肽，或者包含与SEQ ID NO:2序列具有至少70%同一性的序列的多肽，以及依照优先递增的顺序，包含与SEQ ID勵:2序列具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的序列的多肽；b)包含SEQ ID N0:4序列中21-67位氨基酸(代表了 L20h_Tsl蛋白的成熟形式)的多肽，或者包含与SEQ ID N0:4序列中21-67位氨基酸具有至少70%同一性的序列的多肽，以及依照优先递增的顺序，包含与SEQ ID N0:4序列中21-67位氨基酸具有至少75%、80%、85%、90%或95%同一性的序列的多肽。有利的是，在实施本发明时，可使用包含以上定义的多肽a)和多肽b)的混合物，或者包含以上定义的多肽a)和/或多肽b)并组合抗毛线虫属抗体所识别的一种或多种其他抗原性多肽的混合物，例如，衍生自PCT申请WO 2007/090960中所述的NBLl和411抗原的一种或多种多肽。更具体地，本发明的主题是用于检测生物样品中是否存在抗毛线虫属抗体的方法，所述方法的特征在于其包括-在允许以上定义的多肽a)和/或多肽b)与可能存在于所述样品中的抗毛线虫属抗体之间形成抗原/抗体复合物的条件下，使所述生物样品与所述多肽a)和/或所述多肽b)接触；和-通过任何适当的手段检测可能形成的抗原/抗体复合物。一般来说，所述生物样品为血清样品，其可得自于属于可被毛线虫属感染的物种并且需要检测是否存在此寄生虫的任何个体(哺乳类、鸟类或者爬行类)。所述样品最好是从哺乳类中获得的，例如从牲畜或者从病人中得到。与每种多肽单独使用相比，这种组合尤其使扩大反应谱及扩大检测体液应答的时间窗成为了可能。因此，上述定义的多肽b)本身也是本发明的主题的一部分。本发明特别包括嵌合多肽，其包含一个或者多个拷贝的上述多肽a)和/或一个或者多个拷贝的上述多肽b)，并且，任选地，所述多肽a)和/或所述多肽b)与一种或者多种异源多肽融合，例如源于PCT申请WO 2007/090960中所述的NBLl及411抗原的一种或多种多肽。本发明的主题还涉及编码本发明多肽b)或者编码本发明嵌合多肽的多聚核苷酸，以及包含所述多核苷酸的重组载体和由所述载体转化的宿主细胞。本发明的主题还涉及包含上述多肽a)和多肽b)的组合物，或者是包含上述多肽a)和多肽b)并组合可由抗毛线虫属抗体识别的一种或者多种其它抗原性多肽的组合物。例如，衍生自PCT申请WO 2007/090960中所述的NBLl和411抗原的一种或多种多肽。上述定义的多肽a)和b)可以被应用到已知的各种检测抗体的方法中。举例来说，特别是，酶联免疫吸附测定(ELISA)类的方法(直接、间接或夹心法)、珠子微凝集法和电泳转移结合免疫标记法。本发明的主题还涉及用于检测生物样品中是否存在抗毛线虫属抗体的试剂盒，其特征在于其包含上述定义的多肽a)和/或多肽b)，以及，在适当的情况下，还包含适用于·组成允许抗原/抗体复合物形成的反应介质的缓冲剂和试剂，并且任选地包含检测所述抗原/抗体复合物的工具。任选地，其还可包含可由抗毛线虫属抗体识别的一种或多种其它抗原性多肽。比如，衍生自PCT申请WO 2007/090960中所述的NBLl和411抗原的一种或多种多肽。所述多肽最好被固定在固体支持物上。可使用的固体支持物的非限定性实例有微量滴定板、珠子、微珠或微粒、试纸条(strip)等。所述试剂盒也包含参照样品，比如一种或者多种阴性血清和一种或者多种阳性血清。本发明的主题还涉及上述多肽b)在制备所述多肽的特异抗体中的应用。这些多肽可以被运用到已知的各种制备抗体的方法中。如，可将其用于(在任选地加入合适的佐剂后)免疫动物。为了能够从生物流体中纯化针对所述多肽的特异抗体，也可将其连接到亲和色谱的支持物上。所述生物流体可以是，例如，之前被所述多肽免疫的动物的血清，或者是杂交瘤细胞上清液；还可以是被毛线虫属感染的动物的血清，这种情况下，期望分离出针对所述多肽的特异抗体亚群。本发明还涉及上述多肽b)的任何特异抗体。其可包括多克隆抗体或者单克隆抗体。针对多肽的特异抗体可以通过已知的各种手段获得，特别是包括以下的传统方法用所述多肽(任选地添加合适的佐剂)来免疫动物和回收其血清(用于产生多克隆抗体)或者其淋巴细胞(用于产生单克隆抗体)。上述的多肽a)和b)及编码这些多肽的多聚核苷酸可以被用于制备免疫原性组合物，尤其是抗毛线虫属(anti-Trichinella)疫苗。本发明的主题还涉及免疫原性组合物，其包含上述定义的一种或者多种多肽a)和/或一种或者多种多肽b)，或者一种或者多种编码所述多肽的多核苷酸，所述多肽a)和/或多肽b)或多核苷酸与用于增强免疫应答的一种或者多种佐剂组合。任选地，所述组合物还可包含由抗毛线虫属抗体识别的一种或者多种其他免疫原性多肽，比如，衍生自PCT申请WO 2007/090960中所述的NBLl和411抗原的一种或多种多肽。
根据一种优选的实施方式，本发明的免疫原性组合物是疫苗。能够增强肽免疫原性的多种佐剂都是本领域技术人员已知的。佐剂的实例包括明矾(氢氧化铝)、弗氏(Freund’ s)完全佐剂或弗氏不完全佐剂(IFA)、脂质体、病毒体(重组病毒包膜)以及胞壁酸的肽衍生物等。在使用疫苗的情况下，一定要选择药理学上可以接受的佐剂，优选佐剂的实例有水包油乳化佐剂，比如SEPPIC公司出售的名为M0NTANIDEISA 70 和 MONTANIDE ISA 775 的佐剂，其还描述于在专利 EP 480982、EP 825875、US5422109、US 6251407 和 US 6610309 中。在恰当的情况下，特别是涉及短肽((30个氨基酸)的时候，所述多肽可以连接到载体蛋白上。载体蛋白的实例有KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白、破伤风类毒素或白喉类毒素。也可以通过将多个拷贝的相同多肽彼此组合，并任选地与其他肽表位组合，以形成嵌合多肽形式的多表位组合物，或者通过多聚链，例如多聚赖氨酸，形成多 表位组合物。如果使用多核苷酸作为免疫原，则免疫原性组合物的形式可以是插有待施用的多核苷酸的重组载体。可使用的病毒载体有，例如痘病毒、腺病毒、反转录病毒、慢病毒、疱疹病毒和AAV病毒(腺病毒相关病毒)等。其形式也可以是由一种或者多种含有所述多核苷酸的表达载体转化的非病原菌。还可以以裸露DNA的形式直接施用所述多核苷酸，或者将其引入脂质体中。在使用疫苗的情况下，则优选使用非病原菌(例如乳酸菌，或者非致病的大肠杆菌(Escherichia coli)或者猪沙门氏菌(Salmonella suis)菌株)，或者是从疫苗病毒株衍生的载体，例如衍生自伪狂犬病(奥耶斯基氏病(Aujeszky’ s disease))病毒的疫苗株的载体。下文中的进一步说明将有助于更清楚地了解本发明，其涉及阐明L20h_Ts3和L20h-Tsl抗原用于毛线虫病的免疫诊断中的用途的实施例。实施例I :L20h-Ts3和L20h_Tsl抗原的鉴别，及以重组蛋白的形式在原核表达系统中产生这些抗原使用通过实验方法感染有旋毛形线虫的猪的血清及其肠粘膜培养上清，进行毛线虫早期发育阶段的(感染小鼠后14小时、20小时和48小时)cDNA表达文库的免疫筛选。在感染小鼠后14和20小时得到的cDNA文库中的41个克隆中鉴别到了 L20h_Ts3基因。这些克隆之一的核苷酸序列及由此推导出的多肽序列显示在图IA中。所述核苷酸序列的长度为398bp，包括33bp的3’非编码区(UTR)，推定的多聚腺苷酸化信号(在图IA中以下划线表示)和开放读码框，该开放读码框编码的蛋白具有106个氨基酸，分子量为11906. O道尔顿，等电点为4. 21。根据BENDTSEN等人的算法(BENDTSENet al., J Mol Biol，340，783_95，2004)，没有鉴定出肽信号。对于其同源蛋白的数据库搜索显示，推导出的L20h-Ts3多肽序列与称作SML-3的旋毛形线虫蛋白(⑶ILIANO et al.，IntJ Parasitol, 39，515-24，2009)有高度的同一性(91%)。用BamHI-NotI (New England BioLabs, Beverly, Massachusetts)酶切该克隆后，将含有完整的L20h-Ts3编码序列的限制性酶切片段亚克隆到pGEX-6P-l载体(GenBankU78872)中。此载体拥有位于N-末端的日本血吸虫(Schistosoma japonicum)谷胱甘肽S转移酶标签(GSTsj) (GSTsj与毛线虫属不存在免疫交叉反应)。由此而产生称为PGEX-6P-1- (L20h-Ts3)的表达载体，其编码包含L20h_Ts3全长序列并且N末端带有GSTsj标签和C末端带有多组氣酸标签的重组蛋白。在感染小鼠后20小时和48小时得到的cDNA文库的121个克隆中鉴别到了L20h-Tsl基因。这些克隆之一的序列在图IB中给出。它的长度为339bp，包括139bp的3’非编码区，推定的多聚腺苷酸化信号(在图IB中以下划线表示)，和开放读码框，该开放读码框编码的蛋白具有67个氨基酸，分子量为7834. 9道尔顿，等电点为4. 42。根据BENDTSEN等人的算法(2004)，鉴定出一个具有20个氨基酸的信号肽(在图IB中以黑体字显示)。其同源蛋白的数据库搜索显示，此蛋白与已知的毛线虫属蛋白没有同源性。此克隆经由BamHI-NotI (New England BioLabs, Beverly, Massachusetts)酶切后，将编码L20h-Tsl中Tyr21-Ala67片段的限制性酶切片断(对应于没有信号肽的成熟蛋白)亚克隆到PGEX-6P-1载体中。由此产生称为pGEX-6P-l-(L20h-Tsl)的表达载体，其编码包含成熟形式的L20h-Tsl序列并且N-末端带有GSTsj标签和C-末端带有多聚组氨酸 标签的重组蛋白。将pGEX-6P-l-(L20h-Ts3)或者 pGEX_6P_l-(L20h_Tsl)载体用于转化大肠杆菌(BL21株)中。加入0.5mM(终浓度)的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)并在37° C、225rpm转速的条件下温育3小时来诱导表达每个重组蛋白(含有N-末端GSTsj标签或者C-末端多聚组氨酸标签)。将诱导后的细菌离心(4000Xg、20分钟、4° C)，然后重新悬浮在添加有O. 5mg/mL溶菌酶的裂解缓冲液(20mMTris_HCl，pH 8. 0;150mM NaCl)中，并以在液氮中三次冻融循环的方式裂解。接下来，在裂解物中加入5 μ g/mL的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)，并在37° C温育15分钟。然后，将裂解物与经过裂解缓冲液预平衡的Ni-NTA基质(GE HealthcareEurope, Orsay, France) —起置于 50 毫升的 Falcon 维形底管(Becton Dickinson, LePont-De-Claix, France)中，并放在旋转式摇床上于4° C温育I小时30分钟。为了除去没有结合的蛋白或杂质，将裂解物-基质混合物上样到ro-ΙΟ柱子(GE HealthcareEurope, Orsay, France)上，而后转移到新的50毫升FalcorT管中，使用50毫升的清洗缓冲液I(20mM Tris-HCl, pH 8. 0;300mM NaCl)，于旋转式摇床上4 ° C清洗30分钟。将混合物离心(1500Xg，4° C)5分钟后，用50毫升清洗缓冲液II(20mM Tris-HCl, pH8. O; 300mM NaCl; 30mM咪唑)于4° C清洗4次，每次30分钟。清洗后再最终离心5分钟(1500 Xg, 4。C)。最后，用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl, pH 8. 0;300mM NaCl; 500mM 咪唑)洗脱每个重组蛋白，并使用分光光度计在280纳米波长测定浓度。重组蛋白被分装成小份，并置于10%的甘油中放置在-20° C保存。GSTs j-L20h_Ts3 和 GSTs j-L20h_Tsl 融合蛋白的变性电泳(SDS-PAGE)凝胶分别显示在图2A和图2B中(第一泳道为分子量标准)。在这些凝胶中，GSTsj-L20h-Ts3和GSTsj-L20h-Tsl蛋白都在预期的融合蛋白分子量位置呈现为单一条带。实施例2 L20h-Ts3和L20h_Tsl蛋白在蛋白质印迹法中的免疫反应性抗毛线虫血清将200、1000、20000条旋毛形线虫(ISS004，意大利罗马国际毛线虫参照中心)或者布氏毛形线虫(ISS100)的感染性幼虫感染无特定病原猪(SPF猪)或者传统农场养殖的猪体内。在感染之前48小时(阴性对照)和感染开始后(pi)第5、10、15、20、25、30、40、50和60天取血样。另外，还使用了来源于感染有20000个旋毛形线虫(ISS003)或者布氏毛形线虫(ISS002)L1M幼虫的SPF猪血清。在感染之前24小时(阴性对照)，和感染后第1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、20 和 25 周取血样。2004年，从位于Ille-et-Vilaine (法国)的舍养工厂化农场收集猪血清，经由人工消化法测定为毛线虫病阴性，并将其作阴性参照血清。蛋白质印迹法用蛋白质印迹法分析重组L20h_Ts3和L20h_Tsl抗原(以GSTsj-L20h_Ts3和GSTsj-L20h-Tsl融合蛋白的形式)的免疫反应性。在变性条件下对重组蛋白进行电泳(15%SDS_PAGE，每孔700ng蛋白质)，然后将蛋白转溃到硝酸纤维膜上。将膜用含有0.1% Tween 20和5%脱脂奶的磷酸盐缓冲液 (PBS-T)于4° C过夜温育而封闭后，使用PBS-T清洗3次，每次5分钟。然后在常温下，使用以下方式温育膜I小时-对于L20h_Ts3，使用来自经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的SPF猪的血清，所述血清为感染后的第_2、5、12、15、20、28和60天所收集，并以1/300的比例稀释于含有5%脱脂奶的PBS-T中；-对于L20h_Tsl，则使用经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的SPF猪的血清，所述血清为感染后第_1、7、14、21、28、49和84天所收集，并以1/300的比例稀释于含有5%脱脂奶的PBS-T中。在PBS-T中清洗膜3次，每次5分钟后，将带有过氧化物酶标记的兔抗猪IgG第二抗体按照1/10000的比例稀释，使其与膜一起在常温下温育I小时。再清洗3次后，用"ECL PLUS WESTERN BLOTTING AND AMERSHAM HYPERFILM ECL"试剂盒(GE HealthcareEurope, Orsay, France)进行显色。L20h~Ts3:图3中显示了，在感染后第-2、5、12、15、20、28和60天，从经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的SPF猪血清中所得到的结果。这些结果表明，从感染后第20天起(从感染后第15天开始可见微弱的条带)，可以清晰地识别到重组L20h-Ts3抗原(GSTsj-L20h-Ts3)，并至少持续到感染后第60天。L20h~Tsl:所述结果显示在图4中。这些结果表明从感染后第28天起(从感染后第21天起，可见微弱的条带)，可以由经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的SPF猪血清清晰地识别到重组L20h-Tsl抗原(GSTsj-L20h-Tsl)，并至少持续到感染后第84天(图4A和图4B)(应该注意的是，在感染后的第112天，另外一头经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的SPF猪也可以检测到；实验数据未显示)。感染后第60天，在感染200个旋毛形线虫LlM幼虫的猪中，也可以识别重组L20h-Tsl抗原(GSTsj-L20h-Tsl)(可见微弱条带；实验数据未显不)O实施例3 :重组L20h_Ts3抗原在间接ELISA中的免疫反应性用间接ELISA估测重组L20h_Ts3抗原的免疫反应性，并将其与旋毛形线虫的E/S抗原及PCT申请WO 2007/090960中描述的NBLl抗原进行比较。
所用感染毛线虫的猪的血清如上文实施例2中所述。共使用220个阴性猪参照血清来判定诊断阈值。作为参照的E/S抗原来自于Pourquier研究所(法国Montpellier)出售的ELISA试剂盒。ELISA测定的方案如下在微量滴定板中(Immuno 96Microffell PlatesF96MaxiSorp, Nunc, Roskil,丹麦),每孔加入100 μ L经由敏化缓冲液(12mM碳酸钠；35mM碳酸氢钠，pH 9.6)稀释的抗原，并在37° C温育2小时。接下来，将每孔用250 μ L的清洗缓冲液(蒸馏水，O. 05% Tween 20)清洗5次，然后与200 μ L的饱和缓冲液(PBS, 1%明胶；O. 05% Tween 20) —起在37° C温育30分钟。用清洗液清洗5次后，每孔加入200 μ L稀释于饱和缓冲液中的第一抗体(血清)，在37° C温育I小时。用清洗液清洗5次后，每孔加入100 μ L标记有过氧化物酶的兔抗猪IgG第二抗体(以1/50000的比例稀释于饱和缓冲液中)，并在37° C温育I小时。最后，用清洗液清洗5次，每孔加入IOOyL3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB，Zymed，美国加州)用于暗室显色。每孔中加入50 μ L12. 5%的硫酸以终止反应，并使用Labsystems iEMS Reader MF酶标仪配合Ascent 2. 6软件(Thermo LabSystems, Cergy Pontoise,法国)在 450nm 波长进行读数。·通过测试1/10、1/100和1/300的比例稀释的血清样品，和每孔中50ng、250ng、500ng和I μ g的L20h-Ts3蛋白量，来确定ELISA的最佳条件。然后，所得结果用Wilcoxon-Mann-Whitney检验的方法进行分析。这样，在1/10的稀释比例的血清和使用250ng L20h-Ts3蛋白时，阳性样品和阴性样品的数值之间的差异最大。因此，这些条件被用于接下来的ELISA中。由此，这些条件被用于其余的测试。诊断阈值由阴性参照血清来确定。其计算方法依据使用由Office International des Epizooties[世界动物卫生组织]定义的公式(Manual of diagnostic tests and vaccines for land animals,第6版，2008，第 2.01. 6章)，对应于在450nm波长所测OD值的平均值再加上3倍标准差。图5至13显示了所述结果。图5给出了从220个阴性参照血清中测量到的光密度值。根据这些测量结果而确定的诊断阈值为0. 33个OD单位。图6给出了在由20000个LlM旋毛形线虫LlM幼虫感染的SPF猪血清(▲)或者传统农场养殖猪血清(■)中测量到的光密度值，其中所述血清收集于感染后的第5(猪
1-3)、12 (猪 4-6)、15 (猪 7-9)、20 (猪 10-12)和 60 (猪 13-15)天。在其间无法用 E/S ELISA进行检测的盲窗期以阴影示出。图7显示了在感染后的数周中(沿X坐标轴)，以L20h_Ts3抗原测试时，经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的3头SPF猪的血清的光密度变化(沿y坐标轴)。图8显示了在感染后的数周中(沿X坐标轴)，以E/S抗原测试时，经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的3头SPF猪的血清的光密度变化(沿y坐标轴)。％E/P通过以下公式定义(所测样品的OD值)/(阳性对照样品的OD平均值)X 100。图9显示了在感染后的数周中(沿X坐标轴)，以NBLl抗原测试时，经实验感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的3头SPF猪的血清的光密度变化(沿y坐标轴)。

图10显示了在感染后的数周中(沿X坐标轴)，以L20h_Ts3抗原测试时，经实验感染20000个布氏毛形线虫LlM幼虫的3头SPF猪的血清的光密度变化(沿y坐标轴)。图11显示了在感染后的数周中(沿X坐标轴)，以E/S抗原测试时，经实验感染20000个布氏毛形线虫LlM幼虫的3头SPF猪的血清的光密度变化(沿y坐标轴)。图12显示了在感染后的数周中(沿X坐标轴)，以NBLl抗原测试时，经实验感染20000个布氏毛形线虫LlM幼虫的3头SPF猪的血清的光密度变化(沿y坐标轴)。图13显示了由SPF猪(▲)或传统农场养殖猪(■)的血清测量的光密度数值，其中所述猪经实验感染200个(猪1-3)或者1000个(猪4-6)旋毛形线虫LlM幼虫，并使用L20h-Ts3抗原进行检测。当经实验使猪感染20000个旋毛形线虫LlM幼虫的时候，能够使用L20h_Ts3抗原对于1/6的猪(猪8)在感染后第15天检测到，和对于4/6的猪在感染后第20天检测到(图6)。而使用E/S ELISA，则在第25天之前都检测不到感染。所获得的实验结果因猪自 身健康状况而异，特别是，SPF猪能够比传统养殖的猪更早地被检测出来。血清转化伴随有一系列具有高滴度的体液应答反应，并在2/3感染有旋毛形线虫的猪中持续到感染后第25周，在1/3感染有旋毛形线虫的的猪中持续到感染后第12周(图7)。使用E/S ELISA，3头猪中有I头较早地(早I周)被检测到(图8)。对于同样的3头猪，使用NBLl抗原，从感染后第3周起可检测出抗毛线虫属抗体(图9)。另一方面，3头猪中的2头在感染后第7周出现了应答水平的下降。对于第3头猪，从12周后就无法再检测到抗毛线虫属抗体的存在了。当经实验使猪感染20000个布氏毛形线虫LlM幼虫的时候，用L20h_Ts3抗原可以比使用E/S ELISA早1-2周检测到血清转化(图10和11)。对所检测的3头猪，所得光密度值从感染后第3周开始处于高水平，并持续到感染后第25周。对于同样3头猪，使用NBLl抗原(图12)则可以从感染后第2周在其中I头猪的血清中测出抗毛线虫属抗体，并且一直持续到感染后第16周。在第2头猪的血清中，只有在感染后的第3和4周可以测到抗毛线虫属抗体。最后，在第3头猪的血清中检测不到抗毛线虫属抗体。此外，在用中等感染剂量(1000个旋毛形线虫LlM幼虫)感染的3/6头猪中，从感染后第60天可用L20h-Ts3抗原检测到(图13)。同样，所获得的实验结果因猪的自身健康状况而异。准确地说，在2/3的SPF猪和1/3的传统养殖的猪体内都有检测到。而使用低感染剂量(200个旋毛形线虫LlM幼虫)感染的猪则在感染后第60天检测不到。
权利要求
1.抗毛线虫属(Trichinella)抗体识别的抗原性多肽用作检测生物样品中抗毛线虫属抗体的试剂的用途，其特征在于，所述多肽选自 a)包含序列SEQID NO:2的多肽，或包含与序列SEQ ID NO:2具有至少70%同一性的序列的多肽； b)包含序列SEQID N0:4的21-67位氨基酸的多肽，或包含与序列SEQ ID N0:4的21-67位氨基酸序列具有至少70%同一性的序列的多肽。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，使用包含所述多肽a)和所述多肽b)的混合物。
3.抗毛线虫属抗体识别的抗原性多肽，其特征在于，所述抗原性多肽为权利要求I中定义的多肽b)。
4.抗毛线虫属抗体识别的抗原性多肽，其特征在于，所述抗原性多肽由嵌合多肽组成，所述嵌合多肽包含一个或多个拷贝的多肽a)和/或一个或多个拷贝的多肽b)，任选地，所述多肽a)和/或多肽b)与一种或多种异源多肽融合。
5.多核苷酸，其编码权利要求3和4中任一项所述的抗原性多肽。
6.重组载体，其包含一种或多种权利要求5所述的多核苷酸。
7.宿主细胞,其由权利要求6所述的重组载体转化。
8.权利要求3所述的多肽用于制备抗体的用途。
9.抗体，其特异性地识别权利要求3所述的多肽。
10.用于检测生物样品中是否存在抗毛线虫属抗体的方法，所述方法的特征在于，其包括 -在允许由可能存在于所述生物样品中的抗毛线虫属抗体形成抗原/抗体复合物的条件下，使所述生物样品接触权利要求I中定义的多肽a)和/或多肽b);和-通过任何适合的方式检测可能形成的所述抗原/抗体复合物。
11.用于检测生物样品中是否存在抗毛线虫属抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求I中定义的多肽a)和/或多肽b)，以及适合配制允许形成抗原/抗体复合物的反应介质的缓冲剂和试剂。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述多肽固定在固体支持物上。
13.免疫原性组合物，其包含权利要求I中定义的多肽a)和/或多肽b)，或编码所述多肽的一种或多种多核苷酸，所述多肽a)和/或多肽b)或所述多核苷酸与用于增强免疫反应的一种或多种佐剂组合。
14.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物为疫苗。
全文摘要
本发明涉及抗毛线虫属抗体识别的新型多肽。特别地，所述多肽可用于检测抗毛线虫属抗体和预防毛线虫病。
文档编号C07K14/435GK102933597SQ201180009999
公开日2013年2月13日 申请日期2011年2月16日 优先权日2010年2月17日
发明者亚历山大·佐切维奇, 巴尔迪塞拉·乔瓦尼, 桑德兰·A·拉库尔, 波利娜·马切, 伊莎贝尔·瓦莱, 帕斯卡尔·布瓦罗 申请人:国家食品安全环境及劳工局