一种成人T细胞白血病的特异性靶向多肽及其应用的制作方法

本发明涉及一种成人t细胞白血病的特异性靶向多肽及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

成人t细胞白血病（atl，adultt-cellleukemia）是一种恶性的淋巴系统增殖性疾病。

近三十年的研究表明，atl与人类t淋巴细胞白血病1型病毒（htlv-1，humant-cellleukemiavirustype1）的感染密切相关，具体来说，htlv-1编码的病毒蛋白在促进病毒感染复制，进而诱发成人t细胞白血病的过程中扮演极为重要的作用。

由于迄今为止，尚无有效的预防及治疗atl的手段，科学家们开始探索直接以htlv-1病毒蛋白作为靶点的新型治疗方法。

htlv-1病毒基因组，除了正向编码结构基因gag、pol、env，以及调控蛋白tax、rex、p12、p13和p30以外，htlv-1的反义链编码hbz蛋白。hbz蛋白包含3个功能结构域：n末端激活结构域（addomain），c末端碱性亮氨酸拉链结构域（bzipdomain），以及位于中间的中央结构域（cddomain）。

研究证明，hbz的致癌功能通过其c末端碱性亮氨酸拉链结构域参与调节多条细胞信号传导途径得以实现。因此，是否可以通过封闭hbz蛋白的bzip功能结构域来靶向治疗，这是本领域科学家们首先希望能够解决的问题，其次，如果可以通过封闭hbz蛋白的bzip功能结构域来靶向治疗，那么什么样的靶向药物可以封闭hbz蛋白的bzip功能结构域，可以有效地治疗atl，这些都是本领域科学家们亟待研究的问题，这些问题的研究成果将为我们研发治疗atl的抗病毒药物提供一个全新的思路与策略。

技术实现要素：

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种成人t细胞白血病的特异性靶向多肽，其中，所述特异性靶向多肽的序列的通式为：x-y-z-acp-r8；在所述通式中，y所代表的是如seqidno.1所示序列，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；在所述通式中，x所代表的序列为如seqidno.4所示序列，z所代表的序列为seqidno.5所示序列；或者，x所代表的序列为如seqidno.4所示序列，z所代表的序列为空；或者，x与z所代表的序列同时为空。

本发明另一方面提供了一种编码如权利要求1所述的特异性靶向多肽的基因。

本发明再一方面提供了上述的特异性靶向多肽在制备治疗成人t细胞白血病的靶向药物方面的用途。

本发明还一方面提供了一种治疗成人t细胞白血病的靶向药物，其中，所述靶向药物包含如权利要求1所述的特异性靶向多肽。

本发明首次以htlv-1关键病毒蛋白hbz作为靶点筛选出来治疗成人t细胞白血病的特异性靶向多肽，其可以用于制备治疗成人t细胞白血病的靶向药物。以本发明的特异性靶向多肽为基础的靶向药物和靶向治疗手段，与传统的抗肿瘤药物的治疗手段相比，细胞毒副作用较小，为今后研究抗htlv-1和atl药物提供了一个全新的思路和策略。

附图说明

图1为验证实施例1-3的特异性靶向多肽抑制hbz蛋白对ap-1信号通路的调控作用的荧光素酶报告基因检测结果；

图2为验证实施例1-3的特异性靶向多肽抑制白血病细胞的恶性增殖的mtt细胞活力检测结果；

图3为验证实施例1的特异性靶向多肽促进白血病细胞凋亡的流式细胞术检测结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

关于本发明的成人t细胞白血病的特异性靶向多肽的序列设计理念以及技术难题简述如下：

首先，鉴于htlv-1编码的病毒蛋白hbz，其n端具有与c-fos相似的亮氨酸拉链结构域，其致癌功能也正是通过其n端所具有的亮氨酸拉链结构域与c-jun等亮氨酸拉链相关蛋白的相互结合和相互作用得以实现，因此，发明人希望能够设计一种可以人工合成的、且能够阻遏hbz蛋白与c-jun相关蛋白结合（有效封闭hbz蛋白的bzip功能结构域）的靶向多肽，为治疗atl提供新的有效的技术和手段。

其次，c-jun与c-fos形成了复合物对于细胞生命活动具有非常重要的作用，因此，待设计的靶向多肽在阻遏hbz蛋白与c-jun相关蛋白结合的同时，不能干扰fos-jun蛋白复合物的形成。待设计的靶向多肽，一方面要能够与c-jun等相关蛋白竞争，有效封闭hbz蛋白的bzip功能结构域，另一方面，其结构不能与c-jun蛋白过于相似，导致干扰fos-jun蛋白复合物的形成。因此，由于hbz与fos的亮氨酸拉链结构域具有较高的相似性，这给设计靶向多肽带来了很大的技术困难。

发明人综合考察了hbz蛋白、c-fos蛋白以及c-jun蛋白的bzip功能结构域中的静电分布，以及hbz蛋白与c-jun蛋白之间、c-fos蛋白与c-jun蛋白之间的静电互作关系，同时对fos-jun蛋白复合物进行了x射线单晶衍射分析和对卷曲螺旋肽的测算分析，设计了大量的符合设计原则的多肽序列（以下简称hbap（hbzbzipassociatepeptide）序列）。进一步地，在这些复合设计原则的hbap序列基础之上，发明人有考虑到靶向多肽的靶向性和药物输送性能，在每个多肽序列的n端添加了8个精氨酸（简称r8）的细胞穿膜肽，以增加靶向多肽的蛋白转导活性，并可以作为有潜力的药物输送载体。更进一步地，为了避免多肽之间发生相互作用，维持蛋白的构象及其生物学活性，在hbap序列和r8序列之间添加了一个可弯曲的间隔序列acp。

发明人再通过试验来验证所设计的hbap-acp-r8序列是否能够有效地与hbz蛋白结合，阻遏hbz蛋白与c-jun蛋白的相互作用，同时不会影响fos-jun蛋白复合物的形成。

经过大量的设计和验证试验，发明人获得了本发明的成人t细胞白血病的特异性靶向多肽，一方面其对hbz蛋白的bzip功能结构域的亲和性明显高于c-jun蛋白与hbz蛋白之间的亲和性，能够有效封闭hbz蛋白的bzip功能结构域，阻遏hbz蛋白与c-jun相关蛋白结合，另一方面，其对hbz蛋白的bzip功能结构域的亲和性明显高于其对c-fos蛋白的bzip功能结构域的结合能力，或者说其对c-fos蛋白的bzip功能结构域的结合能力弱于c-jun蛋白对c-fos蛋白的bzip功能结构域的结合能力，因此不会影响fos-jun蛋白复合物的形成。

本发明的成人t细胞白血病的特异性靶向多肽，其序列的通式为：x-y-z-acp-r8；在该通式中，y所代表的是如seqidno.1所示序列（leriarleekvktlkaqnselastan），acp所代表的是如seqidno.2所示序列（vqaaidying），r8所代表的是seqidno.3所示序列（rrrrrrrr）；在该通式中，x所代表的序列为如seqidno.4所示序列（rkrk），z所代表的序列为seqidno.5所示序列（mlreqvaqlk）；或者，x所代表的序列为如seqidno.4所示序列（rkrk），z所代表的序列为空；或者，x与z所代表的序列同时为空。

在上述的通式x-y-z-acp-r8中，左侧一端为c末端，右侧一端为n末端。

实施例1

实施例1的特异性靶向多肽的序列通式中，x代表的是seqidno.4所示序列，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是seqidno.5所示序列，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，实施例1的特异性靶向多肽的序列如下：

rkrkleriarleekvktlkaqnselastanmlreqvaqlkvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.6所示序列）。

实施例2

实施例2的特异性靶向多肽的序列通式中，x代表的是seqidno.4所示序列，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是空，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，该特异性靶向多肽的序列如下：

rkrkleriarleekvktlkaqnselastanvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.7所示序列）。

实施例3

实施例3的特异性靶向多肽的序列通式中，x代表的是空，y代表的是seqidno.1所示序列，z代表的是空，acp所代表的是如seqidno.2所示序列，r8所代表的是seqidno.3所示序列；即，该特异性靶向多肽的序列如下：

leriarleekvktlkaqnselastanvqaaidyingrrrrrrrr（如seqidno.8所示序列）。

上述实施例1、2和3的特异性靶向多肽均可以采用人工合成的方式来制备（例如，发明人委托百奇生物科技（苏州）有限公司合成上述实施例1、2和3的特异性靶向多肽）。

在本发明的一个具体实施方案中，提供了编码上述特异性靶向多肽的基因。本领域技术人员在获知上述特异性靶向多肽的氨基酸序列之后，可以根据经验获得对应的编码基因的核苷酸序列。

特异性靶向多肽抑制hbz蛋白与c-jun蛋白之间的相互作用

将表达hbz蛋白的载体pcdna3-mychis-hbz和表达c-jun蛋白的载体pcmv-ha-c-jun共转染至293ft细胞，6小时后分别加入上述实施例1-3的特异性靶向多肽，处理48小时后，裂解细胞并提取细胞的总蛋白，再采用免疫共沉淀技术（co-ip）来分析蛋白的结合情况。

co-ip的处理过程简述如下：20μlproteing预处理1mg总蛋白样品30min后，收集上清蛋白，加入flag抗体，4℃旋转混匀1h，再加入20μlproteing，4℃旋转混匀1h。结合有抗体及目的蛋白的proteing经过缓冲液洗涤5次后，煮沸变性，westernblot检测目的蛋白的表达水平。

检测结果表明：hbz蛋白能与c-jun蛋白结合，然而经过实施例1-3的特异性靶向多肽处理后，显著抑制了hbz与c-jun蛋白复合物的形成。

特异性靶向多肽抑制hbz蛋白对ap-1信号通路的调控作用

为了进一步研究本发明的特异性靶向多肽对hbz蛋白所调控的ap-1信号通路的作用，我们采用了双荧光素酶报告基因技术。我们将hbz蛋白和c-jun蛋白的表达质粒分别转染到对应组别的jurkat细胞中。转染6h后分别加入实施例1-3的特异性靶向多肽进行处理。48h后收集细胞，运用报告基因检测仪检测荧光值。

结果如图1所示，hbz蛋白可显著抑制由c-jun激活的ap-1信号通路。然而，加入了实施例1-3的特异性靶向多肽后，hbz蛋白对ap-1信号通路的抑制作用明显被抵消，该结果进一步证明，实施例1-3的特异性靶向多肽能通过与hbz蛋白结合，从而干扰hbz与其他亮氨酸拉链蛋白的结合，进而影响下游信号通路。

特异性靶向多肽抑制白血病细胞恶性增殖

[33]我们运用mtt技术分析实施例1和实施例3的特异性靶向多肽通过对hbz蛋白功能的抑制是否能影响白血病细胞的恶性增殖。

参见图2，mtt检测细胞活力的实验结果。从图2的结果可以看出，感染有htlv-1病毒的atl-t和tl-om1细胞在监测的96h内细胞生长旺盛，但实施例1和3的特异性靶向多肽的加入可以显著的抑制白血病细胞atl-t和atl-2的恶性增值，且该抑制作用呈现出剂量依赖效应。该结果证明实施例1和3的特异性靶向多肽可以通过与hbz蛋白的互作影响hbz蛋白下游的调控信号通路，最终抑制白血病细胞的生长。

特异性靶向多肽促进白血病细胞凋亡

为了进一步检测本发明的特异性靶向多肽是否影响肿瘤细胞凋亡，我们对经实施例1的特异性靶向多肽处理后的细胞进行annexinv/7-aad（磷脂结合蛋白v/7-氨基放线菌素d）染色，并用流式细胞术检测。检测结果参见图3，实施例1的特异性靶向多肽可诱导25.83%的atl-t细胞发生凋亡。实施例1的特异性靶向多肽作用atl-2细胞24h后，肿瘤细胞atl-2的细胞凋亡率增加（死细胞变多）。

从图3的结果可以看出，本发明的特异性靶向多肽可以通过抑制其蛋白结合能力，显著抑制白血病细胞恶性增值，并促进细胞凋亡。

综上所述，上述多方面的效果验证试验证明了本发明的特异性靶向多肽能够有效封闭hbz蛋白的bzip功能结构域，阻遏hbz蛋白与c-jun等亮氨酸拉链蛋白的结合，进而影响hbz蛋白下游的调控信号通路，最终抑制白血病细胞的恶性增值，并促进白血病细胞凋亡。

因此，本发明的特异性靶向多肽可以用于制备治疗成人t细胞白血病的靶向药物。本领域技术人员可以在获知上述特异性靶向多肽之后，以本发明的特异性靶向多肽为药物活性成分或者药物活性成分之一，或者再结合其他常规辅料，从而获得治疗成人t细胞白血病的靶向药物。

本发明的发明人首次以htlv-1关键病毒蛋白hbz作为靶点筛选出来治疗成人t细胞白血病的特异性靶向多肽，其可以用于制备治疗成人t细胞白血病的靶向药物。以本发明的特异性靶向多肽为基础的靶向药物和靶向治疗手段，与传统的抗肿瘤药物的治疗手段相比，细胞毒副作用较小，为今后研究抗htlv-1和atl药物提供了一个全新的思路和策略。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>浙江师范大学

<120>一种成人t细胞白血病的特异性靶向多肽及其应用

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