专利名称：全人源抗cd33单链抗体zjl101及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程，涉及全人源抗⑶33单链抗体的筛选、鉴定和原核表达，及其在CD33阳性白血病靶向药物制备中的应用。
背景技术：
噬菌体展示抗体技术可以制备全人源的抗体，是将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，从而使异源分子展示于噬菌体表面。主要特点是将特定的分子的基因型和表达型同时出现在一个噬菌体颗粒内，通过DNA测序可以获得特定展示蛋白的序列信息。噬菌体抗体库技术模拟了人类B细胞的分化成熟过程，首先通过分子生物学手段将人类抗体的重链和轻链可变区基因连接起来形成单链抗体(Single-chain variablefragment, scFv),插入曬菌体载体上,使单链抗体scFv展示在卩遼菌体表面,再用特定的抗原筛选出特异性的噬菌体抗体，并用大肠杆菌表达可以表达大量单链抗体。卩遼菌体可以表达抗体结合片段(Fragmentantigen binding, Fab)、单链抗体(scFv)、双链抗体(Diabody)和双特异性抗体(Bispecific scFv, BsAb)等。其中单链抗体(scFv)是目前报道最多的一种小分子抗体，是由抗体识别抗原的可变区Fv段组成。Fv由重链可变区Vh和轻链可变区VL通过连接肽(Iinker)连接构成scFv。所加的linker很重要，必须不影响Fv的构象，目前最常用的是由四个甘氨酸和一个丝氨酸组成的重复3次的序列(ggggs)3。将scFv基因克隆在丝状噬菌体载体pin基因先导序列和pin基因之间，以融合蛋白的形式被导入细菌膜间隙，并组装成scFv，在加入辅助噬菌体M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。PCANTAB-5E载体的特点是，在scFv基因后面含有一段编码Tag尾肽(E-Tag)的序列,在E-Tag后面有一个琥拍(Amber)终止密码,位于scFv基因与PlII基因之间，在抑制性细菌TGl中，这种琥珀密码子只有20%有效，所以在蛋白翻译过程中可以被通读而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此终止子被识别，同时scFv基因在pill基因前终止，形成独立的抗体蛋白，滞留于细胞膜间隙，并在 长时间培养后释放于培养液中，形成可溶性表达。另外，用分子克隆的方法，也可以将scFv基因转移进入pET表达体系，并在大肠杆菌中实现闻表达而获得单链抗体。单链抗体具有结构简单、相对分子量小、穿透性强、免疫源性低等优点，是一种理想的载体。构建全人源抗体库目的是寻找一种能与特定白血病相关抗原(如CD33等)特异性结合的单链抗体scFv，这类特异识别肿瘤细胞的单链抗体本身或者经过基因工程改造成其它的抗体形式后，可以作为抗肿瘤药物进行开发；其次可以作为药物载体，如偶联药物、毒素或放射性同位素，进行白血病的靶向治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种全人源抗CD33单链抗体Z几101，具有结构简单、相对分子量小、穿透性强、免疫源性低等优点，是一种理想的药物运输载体。SEQ ID NO I是该单链抗体的DNA序列
atggcccagg tccagcttgt gcagtctggg actgtagtga agaagcctgg gtcctcggtgaaggtctcct gcaagacttc tggaggcacc ctccccaacc atgccatcaa ctgggtgcgacaggcctctg gacaagggct tgagtggatg ggatggatga gccctaacac tggtgacacaggctatgcac ggaagttcca gggcagagtc accatgacca gggacacctc cataagcacagcctacatgg aactgagcag cctgagatct gacgacacgg ccatatatta ctgtgcgacgggcgaccccc gggttggtca ttcgtggggc cagggcaccc tggtcactgt ctcctcaggtggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggat ctgacatcca gatgacccagtctccaccct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagtcaaaccattg gcagtcattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaaactcctgatctatg gtgcatccag tttgcaaagt ggggtccccg caaggttcac tggcagtggatttgggacag atttcactct caccatcagc agtctacaag ttgaagactt ggcaacttactcctgtcaac agacttacaa taccccccgg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc
总长度为723 bp ；
SEQ ID NO 2是该单链抗体的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Val Val Lys Lys Pro Gly Ser SerVal Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Leu Pro Asn His Ala He Asn Trp ValArg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Pro Asn Thr Gly AspThr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He SerThr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys AlaThr Gly Asp Pro Arg Val Gly His Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gln Met ThrGln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg AlaSer Gln Thr He Gly Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro LysLeu Leu He Thr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly SerGly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Val Glu Asp Leu Ala ThrTyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluHe Lys
其分子量为25212，含有完整的抗体重链可变区Vh和轻链可变区\，中间连接肽为(Gly Gly Gly Gly Ser)3 ;
所述单链抗体的重链可变区(Vh)具有SEQ ID NO 3的的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Val Val Lys Lys Pro Gly Ser SerVal Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Leu Pro Asn His Ala He Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Pro Asn Thr Gly AspThr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He SerThr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys AlaThr Gly Asp Pro Arg Val Gly His Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser含119个氨基酸，其分子量为12764;所述单链抗体的轻链可变区(VJ具有SEQ ID NO 4的的氨基酸序列
Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr He Gly Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Thr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val ProAla Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu GlnVal Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe GlyGln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
含107个氨基酸，其分子量为11519。 本发明的另一个目的是提供全人源抗⑶33单链抗体ZJLlOl在制备白血病靶向药物中的应用。本发明的单链抗体ZJLlOl可以对CD33阳性的白血病细胞，如髓系白血病HL-60和Kasumi-I细胞，产生生长抑制作用。本发明的优点是(I)提供的全人源单链抗体ZJLlOl结构简单，是抗体重链可变EVh和轻链可变区'由连接肽(GGGGS)3连接而成，MW为25.212 kD，且含有完整抗原结合部位；(2)本发明的单链抗体ZJLlOl可以对⑶33阳性的白血病细胞，如髓系白血病HL-60和Kasumi-I细胞，产生生长抑制作用；(3)本发明的单链抗体ZJLlOl分子量小、穿透性强、免疫源性低，可作为药物或药物载体运输药物、同位素或毒素分子，可以治疗CD33阳性的白血病。
图I是ELISA检测噬菌体单链抗体的结合活性。图2 A是噬菌体单链抗体ZJLlOl结构Vh片段序列分析图。图2 B是噬菌体单链抗体ZJLlOl结构\片段序列分析图。图3是阳性噬菌体(展示单链抗体ZJLlOl)对白血病细胞株的特异抑制作用。图4是用SDS-PAGE电泳分析单链抗体ZJLlOl在大肠杆菌HB2151中的表达。图5是大肠杆菌HB2151中表达的单链抗体ZJLlOl的Western Blot分析图。图6是用SDS-PAGE电泳分析单链抗体ZJLlOl在大肠杆菌BL21中的表达和纯化过程。图7是单链抗体ZJLlOl对白血病细胞的特异抑制作用测定。
具体实施例方式本发明结合以下实施例及附图作进一步的说明。实施例I :噬菌体抗体库的筛选
实验方法使用基因重组表达的⑶33胞外区(⑶33-E⑶)抗原筛选全人源白血病抗体库。用Na2C03/NaHC03将抗原稀释后，加入96孔ELISA板，4°C包被过夜。次日，封闭液封闭I h，加入噬菌体抗体库，37°C孵育2 h。TBS洗涤(第一轮5遍，第二轮10遍，第三、四轮10遍)。用甘氨酸-盐酸(pH 2. 2)洗脱并收集噬菌体，Tris-HCl中和至pH 7.0，侵染对数期厶 coli TG1，37°C静置 20 min，取 10 mL 测滴度。其余转至 20 mL 2XYT-A-G，37°C振摇培养至OD6tltlnm达到0. 5，然后加入辅助噬菌体，37°C振摇I h，离心，沉淀重悬于200 mL2 X YT-AK, 30°C振摇过夜，次日，收集噬菌体。
实验结果噬菌体抗体库经四轮筛选后，得到105倍的富集，见表I。
权利要求
1.一种全人源抗⑶33单链抗体ZJLlOl，SEQ ID NO I是该单链抗体的DNA序列，SEQID NO 2是该单链抗体的氨基酸序列，该单链抗体的分子量为25212，含有完整的抗体重链可变区Vh和轻链可变区'，中间连接肽为(Gly Gly Gly Gly Ser )3，其重链可变区Vh的氨基酸序列为SEQ ID NO 3，含119个氨基酸，其分子量为12764，轻链可变区'的氨基酸序列为SEQ ID NO 4，含107个氨基酸，其分子量为11519。
2.根据权利要求I所述的一种全人源抗CD33单链抗体ZJLlOl在制备白血病靶向药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种全人源抗CD33单链抗体ZJL101。通过噬菌体展示技术，以人CD33-ECD蛋白做为靶抗原从高容量的全人源白血病噬菌体抗体库中经多轮筛选，并在大肠杆菌中诱导表达出单链抗体ZJL101，并经过Ni柱亲和纯化而获得。本发明获得的全人源抗CD33单链抗体ZJL101能够特异抑制CD33阳性的白血病细胞株HL-60和Kasumi-1的生长，该单链抗体本身及其可变区序列经过基因工程改造成其它的抗体形式后，可作为治疗药物或药物运载体用于CD33阳性的白血病的靶向治疗。该单链抗体具有结构简单、免疫源性低、特异性强、相对分子量小、穿透性强等优点，是一种理想的靶向药物和药物运载体。
文档编号A61K39/395GK102952191SQ20121034374
公开日2013年3月6日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者詹金彪, 范娜娜, 张珍珍, 林莉, 丁倩, 汤沁, 代争 申请人:浙江大学