专利名称：一种能识别草鱼IgM的单链抗体C1B3的制作方法
技术领域：
本发明涉及水产养殖品种对病原体的免疫响应，具体涉及一种能识别草鱼血清中抗体IgM的单链抗体。
背景技术：
草鱼是我国淡水养殖业重要的养殖品种之一，检测病原体的感染和通过疫苗免疫途径防治病原体的感染，是草鱼高产的重要保障。IgM存在于大多数真骨鱼类血清中，也存在于草鱼中，是个体发育过程中最早出现的抗体，也是初次体液免疫应答中最早出现的抗体。病原体的感染与IgM表达水平具有明显的响应关系，因此检测草鱼血清中IgM的水平， 可以提示草鱼新近是否发生感染。抗体是研究蛋白表达水平与诱导信号相互关系的有力工具，可应用于研究草鱼对病原体的免疫应答、疫苗效价测定。噬菌体抗体展示技术是近年来出现的一种基因工程抗体表达和筛选的新技术，它是将抗体片段基因通过与噬菌体的外壳蛋白基因融合，而将抗体表达于噬菌体颗粒的表面。由于表达的抗体具有生物活性并可与其相应的抗原相识别，因此可根据抗原抗体结合的特异性进行筛选、富集克隆带有目的抗体的噬菌体。该技术将噬菌体表面表达的抗体的基因型与表现型联系在一起，把抗原抗体结合的特异性同噬菌体的可扩增性联系起来，成为一种高效的筛选体系。由于该技术的宿主细胞是大肠杆菌，因此大大优于依赖于动物的多克隆抗体和依赖于杂交瘤细胞的单克隆抗体的制备过程，使得特异性抗体的筛选和生产更加简便高效，并能大量生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种识别草鱼IgM的单链抗体C1B3，该单链抗体C1B3通过噬菌体展示技术制备。本发明的优点在于，提供一种检测草鱼免疫反应的工具，减少了检测的成本，可以针对病原体的感染，检测草鱼血清中的IgM的水平。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案 编码单链抗体C1B3基因的DNA序列如下
GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCC CTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAA AGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCA TCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTAT TACTGTGCAAGAGAGACGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTGTCGACAGGTGGAGG CGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGA CTCCAGGAGAAACAGTCAGTCTTTCCTGTAGGGCCAGCCAGAGTATTTACAAGAACCTACACTGGTATCAACAGAAA TCACATCGGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCTGATTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAG TGGATCAGGGACAGATTACACTCTCAGTATCAACAGTGTGAAGCCCGAAGATGAGGGAATATATTACTGTCTTCAAG GTTACAGCACACCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCG
3TATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATT TACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAG
单链抗体C1B3的预测氨基酸序列为
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFII SRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARETGYYFDYWGQGTTLTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPATLSVTP GETVSLSCRASQSIYKNLHWYQQKSHRSPRLLIKYASDSISGIPSRFTGSGSGTDYTLSINSVKPEDEGIYYCLQGY STPYTFGGGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA.
一种识别草鱼IgM的单链抗体C1B3的制备方法
(1)从健康小鼠的骨髓干细胞、外周血淋巴细胞和脾脏细胞中提取mRNA；
(2)将得到的mRNA反转录为cDNA，用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物，通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增；
(3)用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接；组成单链抗体基因，然后与具同样酶切位点的噬菌体表达载体Pcantab 5E连接，电转移至大肠杆菌E. coli NM522中，获得鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA文库；
(4)进行10次电转移，合并10次电转移得到的cDNA文库，该cDNA文库的效价为 1. 2 X IO9 ；
(5)从草鱼血清中提取IgM，用硫酸铵盐析法和ftOteinA柱层析的方法纯化IgM，并将草鱼IgM吸附在塑料管壁上；
(6)用吸附在塑料壁上的草鱼IgM对步骤(4)中得到的效价为1.2X109的鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA抗体文库进行三轮淘选，得到cDNA抗体文库的菌液；
(7)将菌液涂抹在氨苄抗性的平板上，37°C培养至长出单菌落；
(8)选取单菌落，用ELISA方法鉴定可特异识别草鱼IgM的单链抗体阳性克隆株，阳性克隆中OD45tlnm值最高的命名为C1B3菌株；
(8)对C1B3菌株进行DNA测序；
(9)用C1B3菌株诱导表达可溶性单链抗体，该单链抗体即为本发明的一种识别草鱼 IgM的单链抗体C1B3。本发明的优点和效果
通过噬菌体展示技术得到的单链抗体C1B3，可以特异性识别草鱼IgM。相对于多克隆抗体和杂交瘤制备的单克隆抗体，本发明的抗体制备过程更为简单，并可以通过细菌的发酵大量生产，减少人力物力消耗。利用本发明单链抗体C1B3为识别工具，以草鱼呼肠孤病毒(GCRV)为病原体为例，感染草鱼，成功检测到病毒感染后草鱼IgM诱导表达水平的变化。 其应用前景为用草鱼的抗血清为一抗，以本发明的单链抗体为二抗，可用于其他各种病原体诱导草鱼IgM水平变化的检测，因此可以将其开发为一种鱼病的免疫学检测试剂盒，用于草鱼对病原体免疫响应的检测，以及人工疫苗效价的鉴定。目前未见通过IgM水平的变化来检测草鱼对病原体免疫反应的方法，而针对草鱼人工疫苗的效价鉴定目前只能依赖于哺乳动物的免疫反应检测，不能精确的反应草鱼自身的免疫反应。本发明的单链抗体C1B3的主要优点在于提供了一种检测草鱼免疫反应的工具，减少了检测的成本，可以针对病原体的感染，检测草鱼血清中的IgM的水平。
图1为ELISA对单链抗体C1B3与草鱼IgM特异性结合的分析图。图2为ELISA对感染草鱼出血病毒后血清中IgM水平变化的分析图。
具体实施例方式以下结合附图，对本发明作进一步的说明。 一种识别草鱼IgM的单链抗体C1B3的制备方法
(1)从健康小鼠的骨髓干细胞、外周血淋巴细胞和脾脏细胞中提取HiRNA；
(2)将得到的mRNA反转录为cDNA，用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物，通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增；
(3)用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接；组成单链抗体基因，然后与具同样酶切位点的噬菌体表达载体Pcantab 5E连接，电转移至大肠杆菌E. coli NM522中，获得鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA文库；
(4)进行10次电转移，合并10次电转移得到的cDNA文库，该cDNA文库的效价为 1. 2 X IO9 ；
(5)从草鱼血清中提取IgM，用硫酸铵盐析法和ftOteinA柱层析的方法纯化IgM，并将草鱼IgM吸附在塑料管壁上；
(6)用吸附在塑料壁上的草鱼IgM对步骤(4)中得到的效价为1.2X109的鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA抗体文库进行三轮淘选，得到cDNA抗体文库的菌液；
(7)将菌液涂抹在氨苄抗性的平板上，37°C培养至长出单菌落；
(8)选取单菌落，用ELISA方法鉴定可特异识别草鱼IgM的单链抗体阳性克隆株，阳性克隆中OD45tlnm值最高的命名为C1B3菌株；
(8)对C1B3菌株进行DNA测序；
(9)用C1B3菌株诱导表达可溶性单链抗体，该单链抗体即为本发明的一种识别草鱼 IgM的单链抗体C1B3。用一种识别草鱼IgM的单链抗体C1B3检测草鱼IgM的浓度 一、单链抗体C1B3特异性识别草鱼IgM
la.将草鱼IgM和BSA (牛血清白蛋白)分别梯度稀释包被96孔板，4°C过夜； lb.倒掉包被的IgM溶液和BSA溶液，以4%PBSM (每100毫升PBS加入4克脱脂奶粉溶)37°C封闭1小时；
Ic.用PBS洗1次，再加入可溶性单链抗体C1B3，于37 °C保温1小时； Id.用PBST (0. 1毫升吐温20加入100毫升PBS溶液中)洗3次，再用PBS洗3次， 每孔再加入 100 微升 HRP/Anti E-Tag conjugate (HRP/Anti E-Tag con jugate 用 PBSM 稀释，体积比为 1 :10000,HRP/Anti E-Tag conjugate 产品来源于 Amersham Biosciences 公司)，37 °C保温1小时；
Ie. 用PBST洗3次，再用PBS洗3次，每孔再加入100 微升TMB (3，3，5，5，-tetramethylbenzidine, Serva 公司)底物溶液，显色 15 分钟，每孔加入 25 微升2摩尔/升中止反应，用酶标仪分别测定每孔的OD45tlnm值。若检测所得的OD45tlnm值随IgM浓度的增加而增加，且BSA测定的结果不随包被浓度的增加而增加，说明单链抗体C1B3能够特异性的识别草鱼IgM，可以用于对草鱼IgM含量的检测。如图1所示，单链抗体CIB3与实验组草鱼IgM的结合随着草鱼IgM量的增加而增加，而对照组BSA与单链抗体C1B3的结合不随浓度的增加而增加，说明本发明的单链抗体 CIB3与草鱼IgM是特异性结合的，可以用于检测草鱼IgM的含量。二、用单链抗体C1B3检测草鱼出血病病毒诱导的免疫反应
2a.在实验组草鱼的腹腔注射草鱼出血病病毒，在对照组草鱼的腹腔注射生理盐水，每隔M小时对抽实验组草鱼和对照组草鱼各取一次血样，共抽取6次； 2b.用实验组和对照组的草鱼血清包被96孔板，4°C过夜； 2c.倒掉包被溶液，以4%PBSM 37°C封闭1小时； 2d.用PBS洗1次，加入可溶性单链抗体C1B3，于37 °C保温1小时； 2e. 用PBST洗3次，再用PBS洗3次，每孔再加入100微升HRP/Anti E-Tag conjugate, 37 °C保温 1 小时；
2f.用PBST洗3次，再用PBS洗3次，每孔加入TMB底物溶液，显色15分钟，每孔加入 2摩尔/升H2SO4中止反应，酶标仪测定OD45tlnm值。当检测所得的OD45tlnm值显著增加时，说明感染了草鱼出血病病毒的草鱼出现了免疫反应，IgM水平升高；当草鱼未感染草鱼出血病病毒，或者草鱼感染的草鱼出血病病毒还没有扩增到较高的含量时，没有引发草鱼的免疫反应时，IgM含量没有变化，检测所得的 OD45tlnm值没有显著变化。如图2所示，腹腔注射草鱼出血病病毒的实验组草鱼，从第五天开始，血清中IgM 的含量显著性增加，而对照组草鱼血清中IgM的含量一直无显著性差异，说明实验组草鱼在感染了草鱼出血病病毒后第4天开始引发免疫反应，IgM水平开始上升，在第5天具有明显的变化，而对照组草鱼IgM的水平一直没有显著地变化。该实验证明了单链抗体CIB3能够用于草鱼出血病病毒感染后引发的免疫反应的检测。
权利要求
1.一种能识别草鱼IgM的单链抗体C1B3，其特征在于，编码单链抗体C1B3基因的DNA 序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCC CTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAA AGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCA TCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTAT TACTGTGCAAGAGAGACGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTGTCGACAGGTGGAGG CGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGA CTCCAGGAGAAACAGTCAGTCTTTCCTGTAGGGCCAGCCAGAGTATTTACAAGAACCTACACTGGTATCAACAGAAA TCACATCGGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCTGATTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAG TGGATCAGGGACAGATTACACTCTCAGTATCAACAGTGTGAAGCCCGAAGATGAGGGAATATATTACTGTCTTCAAG GTTACAGCACACCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCG TATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATT TACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAG单链抗体C1B3的预测氨基酸序列为MAEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFII SRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARETGYYFDYWGQGTTLTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPATLSVTP GETVSLSCRASQSIYKNLHWYQQKSHRSPRLLIKYASDSISGIPSRFTGSGSGTDYTLSINSVKPEDEGIYYCLQGY STPYTFGGGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA。
2.实现权利要求1所述的一种能识别草鱼IgM的单链抗体C1B3的制备方法，其特征在于，该制备方法包含如下步骤(1)从健康小鼠的骨髓干细胞、外周血淋巴细胞和脾脏细胞中提取mRNA；(2)将得到的mRNA反转录为cDNA，用对应于重链和轻链抗体可变部位DNA的引物，通过PCR技术将抗体的重链和轻链的可变片段的DNA扩增；(3)用一编码可弯曲小肽的DNA小片段将重链和轻链DNA片段连接；组成单链抗体基因，然后与具同样酶切位点的噬菌体表达载体Pcantab 5E连接，电转移至大肠杆菌E. coli NM522中，获得鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA文库；(4)进行10次电转移，合并10次电转移得到的cDNA文库，该cDNA文库的效价为 1. 2 X IO9 ；(5)从草鱼血清中提取IgM，用硫酸铵盐析法和ftOteinA柱层析的方法纯化IgM，并将草鱼IgM吸附在塑料管壁上；(6)用吸附在塑料壁上的草鱼IgM对步骤(4)中得到的效价为1.2X109的鼠源天然抗体噬菌体展示cDNA抗体文库进行三轮淘选，得到cDNA抗体文库的菌液；(7)将菌液涂抹在氨苄抗性的平板上，37°C培养至长出单菌落；(8)选取单菌落，用ELISA方法鉴定可特异识别草鱼IgM的单链抗体阳性克隆株，阳性克隆中OD45tlnm值最高的命名为C1B3菌株；(8)对C1B3菌株进行DNA测序；(9)用C1B3菌株诱导表达可溶性单链抗体，该单链抗体即为本发明的一种识别草鱼 IgM的单链抗体C1B3。
全文摘要
本发明公开了一种能够识别草鱼IgM的单链抗体C1B3，并给出了编码单链抗体C1B3基因的DNA序列及其蛋白质氨基酸预测序列，涉及水产养殖品种对病原体的免疫响应。该单链抗体C1B3通过噬菌体展示技术制备。本发明的优点是，提供一种检测草鱼免疫反应的工具，减少了检测的成本，可以针对病原体的感染，检测草鱼血清中的IgM的水平。附图为ELISA对单链抗体C1B3与草鱼IgM特异性结合的分析图。
文档编号G01N33/569GK102268091SQ20111022349
公开日2011年12月7日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者廖兰杰, 张晓华, 戴和平, 汪亚平, 罗绍祥, 陈丛林 申请人:中国科学院水生生物研究所