一种全人源的抗人死亡受体5的激动剂单链抗体及应用的制作方法

本发明属于基因工程制药领域，涉及全人源抗人死亡受体5(deathreceptor5，DR5)的单链抗体筛选、鉴定、表达和纯化，及其在肿瘤靶向治疗中的应用。发明背景肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligand，也称APO2L)是肿瘤坏死因子超家族的成员，含281个氨基酸，与其他TNF超家族成员一样，TRAIL是II型跨膜蛋白，包含N端的跨膜区域和C端的胞外区域[NaganeM.，etal.Neuro-oncology2010，12(7)：687-700]。TRAIL在体内仅以膜结合型存在，但胞外区域可以通过基因工程方法以可溶形式表达出来并保持一定的活性。目前已知TRAIL在体外均能诱导多种肿瘤细胞的凋亡，作用范围广。体外实验表明，无论膜结合型TRAIL，还是单独以可溶形式存在的胞外区截断型TRAIL，都能迅速诱导多种细胞表面具有TRAIL特异性受体的肿瘤细胞发生凋亡[FanQ.，etal.SciRep.2013，3：3565]。体内外实验表明，TRAIL与死亡受体结合可选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无明显的杀伤作用[SubbiahV.，etal.MolCancerTher2012，11(11)：2541-2546]，因此受到广泛关注。TRAIL可选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对大多数正常细胞无明显的杀伤作用的机制，目前主流观点认为是由于TRAIL有四种膜结合受体，分别是两种死亡受体DR4、DR5，大多分布于肿瘤细胞表面；两种诱骗受体DcR1、DcR2，大多分布于正常细胞表面。死亡受体的胞内结构包含了死亡结构域，能够介导细胞的凋亡，而DcR1的胞内结构不含死亡结构域，DcR2的死亡结构域被截断，因此两个诱骗受体都不能介导细胞的凋亡[SheridanJ.，etal.Science，1997，277：818-821]。但也正是因为其具有多个结合受体，使得其容易产生耐药性[Sheridan，J.，etal.Science，1997，277:818-821；MerinoD.，etal.Molecularandcellularbiology2006，26(19)：7046-7055]，而且其在体内半衰期短(约30分钟)[HerbstRS.，etal.Journalofclinicaloncology：officialjournaloftheAmericanSocietyofClinicalOncology2010，28(17)：2839-2846]。研究发现，TRAIL对于肝脏细胞存在一定的毒性，而这种毒性的产生主要是由于死亡受体DR4介导的[JoM.，etal.NatMed.2000May；6(5)：564-7；SecchieroP.，etal.Blood.2004Jan15；103(2)：517-22；DiPietroR.，etal.Blood2001，97(9)：2596-2603]。为了克服TRAIL的这些缺点，筛选死亡受体DR5特异性的激活性抗体被认为是一种有效方法[HollandPM.Cytokine&growthfactorreviews2014，25(2)：185-193]。DR5作为一个与TRAIL特异性结合的死亡受体，属I型跨膜蛋白，富含半胱氨酸的结构域及死亡结构域。研究表明，死亡受体DR5高水平地表达于许多肿瘤组织，如结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、睾丸癌、前列腺癌等[MengRD.，etal.MolTher.2000Feb；1(2)：130-144；NavalJ.，etal.ExpCellRes.2007Jul1；313(11)：2378-2388；El-DeiryWS.，etal.SeminCancerBiol.2003Apr；13(2)：135-147]。由于死亡受体DR5在细胞分布及作用机制的独特性，使其成为抗肿瘤药物开发的理想靶点。2001年Ichikawa制备出人死亡受体DR5特异的激活型单克隆抗体TRA-8，这是特异性针对人细胞膜表面死亡受体DR5而合成的单克隆抗体，它能特异性地与死亡受体DR5相结合，发挥配体的作用，从而诱导细胞凋亡，目前单克隆抗体TRA-8作为抗肿瘤药物也正处于临床研究阶段[KendrickJE.，etal.Gynecologiconcology2008，108(3)：591-597]。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新的并具有潜在药用价值的全人源抗人死亡受体DR5的单链抗体。本发明通过噬菌体展示技术，以人死亡受体DR5胞外区蛋白做为靶抗原从高容量的全人源噬菌体抗体库中经五轮筛选，获得特征为特异性结合人死亡受体DR5的胞外区，在体外能够激活死亡受体DR5诱导肿瘤细胞凋亡的单链抗体TR2-3。本发明具体技术方案如下：一种全人源的抗人死亡受体5的单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区通过柔性肽连接，所述重链可变区包含重链CDR1、CDR2和CDR3域，所述重链CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，重链CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，重链CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示；所述轻链可变区包含轻链CDR1、CDR2和CDR3域，所述轻链CDR1域的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，轻链CDR2域的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，轻链CDR3域的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；所述柔性肽氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。所述重链CDR1、CDR2、CDR2域和/或轻链CDR1、CDR2、CDR2域可以是经过氨基酸置换或者修饰后得到的氨基酸序列。优选的，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO：2，或者所述重链可变区和轻链可变区被取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明所述全人源抗死亡受体DR5单链抗体TR2-3基因序列全长735个核苷酸，预期有245个氨基酸。具有122个氨基酸的重链可变区(SEQIDNO：1，见图3)和108个氨基酸的轻链可变区(SEQIDNO：2，见图4)，通过15个氨基酸的柔性肽SEQIDNO.9连接。本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述抗死亡受体DR5的单链抗体的方法。全人源单链抗体TR2-3基因连接到表达载体PCANTAB5E，转入大肠杆菌表达宿主HB2151。经0.5mMIPTG、30℃诱导表达20h，利用超声破碎细胞，低温离心去除细胞碎片，将上清液用镍离子亲和层析柱和分子排阻层析柱进行分离纯化单链抗体TR2-3。WesternBlot鉴定分离纯化得到的单链抗体TR2-3。本发明的另一目的是提供表达本发明所述的全人源的抗人死亡受体5的单链抗体的表达载体和/或宿主细胞。本发明的另一目的是提供本发明所述的全人源的抗人死亡受体5的单链抗体在制备具有抗肿瘤作用的药物或诊断试剂中的应用。所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、肺癌、胰腺癌、睾丸癌、前列腺癌等。本发明优点：本发明提供的一种全人源的抗人死亡受体5的单链抗体通过体外试验表明，该单链抗体对结肠癌细胞COLO205和乳腺癌细胞MDA-MA-231均有着明显的抑制作用，具有明显的抗肿瘤活性。同时该单链抗体还实现了在大肠杆菌的可溶性表达，具有制备工艺简单、产品纯度高和易扩大生产等优点。附图说明图1：ELISA检测噬菌体展示单链抗体的结合活性。NC，阴性对照；1-20，克隆序列号。OD450nm数值大于阴性对照3倍以上即为阳性克隆。图2：MTT法进行的单链抗体对结肠癌COLO205细胞活性鉴定结果图。图3：TR2-3重链可变区的氨基酸序列。所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列用下划线标注。图4：TR2-3轻链可变区的氨基酸序列。所述VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列用下划线标注。图5：单链抗体TR2-3基因的表达载体示意图。图6：单链抗体TR2-3通过镍柱进行分离纯化的SDS-PAGE电泳图。1，大肠杆菌破碎上清；2，镍柱纯化穿透液；3，含50mM咪唑的PBS缓冲液洗脱杂蛋白；4，含100mM咪唑的PBS缓冲液洗脱杂蛋白；5，含500mM咪唑的PBS缓冲液洗脱目的蛋白TR2-3；M，蛋白分子量标准。图7：纯化所得TR2-3蛋白利用SEC-HPLC法进行纯度分析结果图。图8：WesternBlot法鉴定纯化得到的TR2-3单链抗体。图9：MTT法检测单链抗体TR2-3对结肠癌细胞COLO205及乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞增值抑制作用。图10：WesternBlot法检测单链抗体TR2-3对结肠癌细胞COLO205中Caspase蛋白活化的作用。具体实施方式以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下面结合具体实施例对本发明进一步说明。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1.人死亡受体DR5蛋白的表达纯化以人死亡受体DR5的cDNA(北京义翘神州公司产品)为模板，PCR扩增死亡受体DR5胞外区(1-130aa)的基因片段，克隆到表达载体pET21b上，转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白表达。表达条件为：按2％的接种量将种子液接种于2×YT-AG培养基中37℃震荡培养至OD600nm＝0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃诱导20h。6000rpm，4℃离心15min，收集菌体；PBS重悬菌体，超声破碎(超声3s，间隙3s，共20min)；12000rpm，4℃离心30min，收集上清；上清分别通过镍离子亲和柱(GE公司产品)及分子排阻层析柱Superdex75(GE公司产品)进行分离纯化，得到的死亡受体DR5胞外区蛋白作为抗原用于后续的单链抗体筛选。实施例2.噬菌体人源单链抗体库的构建噬菌体人源单链抗体库的构建参照文献方法进行[SblatteroD.，etal.NatBiotechnol，2000，18∶74-80；SblatteroD.，etal.Immunotechnology，1998，3：271-278]。以105份健康人外周血及58份肿瘤病人外周血为来源，使用密度梯度离心的方法分离产生抗体的外周血淋巴细胞，提取总RNA，并逆转录合成cDNA(宝生物公司产品)，以此为模版，选用人特异性抗体可变区6条重链上游引物、4条重链下游引物、7条λ链上游引物和3条λ链下游引物进行PCR扩增[SblatteroD.，etal.NatBiotechnol，2000，18：74-80；SblatteroD.，etal.Immunotechnology，1998，3：271-278]，再于其两端分别加上SfiI，NotI两个酶切位点序列和Linker序列，经SOE-PCR连接重链和轻链序列得到单链抗体scFv片段。按常规分子克隆操作，将单链抗体scFv片段克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E的SfiI，NotI两个酶切位点间。将单链抗体scFv片段与噬菌粒pCANTAB5E的连接产物通过电转化的方法转入大肠杆菌TG1超级感受态细胞(biorad公司产品)，收集阳性菌落，得到人源单链抗体库。通过滴度测定表明，最终获得库容为1.1×108的噬菌体人源单链抗体库。实施例3.全人源的抗人死亡受体DR5单链抗体的筛选以包被缓冲液(50mMNaHCO3，pH9.6)稀释死亡受体DR5胞外区蛋白至20ug/ml，取2ml加入免疫管中，室温包被过夜；次日，弃上清，PBS迅速洗涤免疫管3次；2％MPBS(含有2％脱脂牛奶的PBS)，37℃封闭2h；弃封闭液，用PBS迅速洗涤免疫管3次；将噬菌体抗体库(～1012pfu)悬浮于4ml2％MPBS并加入到免疫管中，置于旋转摇床上反复旋转2h，以含有0.1％Tween-20的PBS洗涤免疫管15次，再以PBS洗涤免疫管15次；加入1ml100mM三乙胺，室温旋转孵育10min，进行特异性洗脱；0.5ml1MTris-HCl(pH7.4)缓冲液用于迅速中和洗脱下来的噬菌体；中和后的噬菌体用于感染对数期的大肠杆菌TG1，进行扩增和制备，用于下一轮筛选。实施例4.ELISA鉴定单链抗体的抗原结合活性挑取第五轮筛选后获得的噬菌体单克隆到96孔细菌培养板，每孔加入200ul含109pfuM13KO7的2×YT-AG培养基，37℃震荡培养2h，2000rpm离心10min，弃上清，每孔重悬于200μ12×YT-AK培养基，30℃振荡培养过夜。2000rpm，4℃离心10min，上清液于4℃保存，用于抗原结合活性ELISA鉴定。酶标板的包被：用包被缓冲液(50mMNaHCO3，pH9.6)稀释死亡受体DR5胞外区蛋白至5ug/ml，100ul每孔加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜。取出后，用2％MPBS封闭液37℃封闭2h，离心去除封闭液。将上述获得的单克隆噬菌体上清液加入到包被好抗原的96孔酶标板中，37℃温育2h。TBST洗板10次，每孔加入HRP标记的anti-M13抗体(北京义翘神州产品)，37℃温育1h。TBST洗板10次，加底物TMB显色，酶标仪测定OD450nm值。以M13KO7孔作为阴性对照，以高于阴性对照值三倍以上的作为阳性克隆(图1)。阳性克隆送基因测序公司进行基因测序。实施例5.抗人死亡受体DR5单链抗体的可溶性表达及分离纯化按常规分子克隆操作，将实施例4中得到的8个单链抗体基因3’末端加上6×His标签序列后亚克隆至表达载体PCANTAB5E，转化到大肠杆菌表达菌株HB2151。挑选阳性克隆，培养至OD600nm＝0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃诱导表达20h。6000rpm，4℃离心15min，收集菌体；PBS重悬菌体，超声破碎(超声3s，间隙3s，共30min)；12000rpm，4℃离心30min，收集上清；将上清液经镍离子亲和层析柱(GE公司产品)进行分离纯化，用含不同浓度咪唑的PBS缓冲液洗脱杂蛋白与目的蛋白；12％SDS-PAGE检测收集的样品，将含有目的蛋白成分的洗脱液超滤浓缩，再通过分子排阻层析法(Superdex75，GE公司产品)进一步纯化单链抗体，对于获得的蛋白样品经0.22um无菌滤膜过滤除菌后分装，并于-80℃保存。结果如下表所示，有5个单链抗体蛋白实现可溶性表达，其余3个单链抗体蛋白以包涵体形式表达。单链抗体名称表达形式TR2-1可溶性表达TR2-2包涵体TR2-3可溶性表达TR2-4包涵体TR2-5可溶性表达TR2-6可溶性表达TR2-7可溶性表达TR2-8包涵体实施例6.抗人死亡受体DR5单链抗体的活性鉴定选用细胞表面死亡受体DR5高表达的结肠癌COLO205细胞对获得的5个单链抗体蛋白进行活性检测。在37℃、5％CO2的条件下将COLO205细胞培养至对数期，0.5％胰酶消化细胞后用细胞培养液重悬细胞，并以5.0×104cells/ml的密度接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，在37℃，5％CO2培养箱中培养20h后用2％血清培养基替换原培养基。加入不同浓度的单链抗体，孵育48h，每个浓度设置5个复孔，以不加单链抗体孵育的细胞作为阴性对照；每孔加入10μl的MTT，37℃继续培养4h，弃上清，每孔加入150μ1DMSO，在酶标仪570nm波长处测定光吸收值(OD值)。细胞增殖抑制率计算公式如下，细胞抑制率＝(1-(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank))×100％。MTT分析结果显示，单链抗体TR2-3对结肠癌细胞COLO205有着明显的抑制作用并存在剂量依赖关系，其余4个单链抗体活性较弱(图2)，因此优选得到人死亡受体DR5激动剂单链抗体TR2-3。实施例7.抗人死亡受体DR5单链抗体TR2-3的纯度分析及WesternBlot鉴定对实施例5中纯化得到的TR2-3蛋白利用分子排阻法在HPLC系统(LC-2010AHT，SHIMADZUCorp.，Japan)上进行纯度分析，所用色谱柱为ShodexPROTEINKW-802.5(SHOWADENKOK.K.，Japan)，流动相为0.2M磷酸缓冲液(pH7.6)，含0.1MNa2SO4，流速为0.7ml/min。结果显示，纯化后的TR2-3蛋白纯度为>96％(图7)。用BCA法进行蛋白含量测定(biouniquer公司产品)，结果显示，TR2-3产量达12mg/L，实现单链抗体TR2-3在大肠杆菌的高效可溶性表达与分离纯化。峰#保留时间面积高度面积％高度％10.19213461320.0980.25729.29023221250.1690.244310.8974396213663.1942.661411.86813225614947096.09996.345515.07460612540.4400.494总计137625251347100.000100.000将纯化得到的单链抗体进行SDS-PAGE电泳，4℃，100mA恒流转印100min，将蛋白转印到PVDF膜(Millipore公司产品)；转印结束，将膜置于5％MilkTBST(含有5％脱脂牛奶和0.1％吐温20的TBS)中室温封闭1h；用5％MilkTBST按1∶5000稀释Anti-6×Hisrabbitpolyclonalantibody抗体(上海生工产品)，室温孵育2h，TBST洗涤3遍，每次10min；用5％MilkTBST按1∶2500稀释HRP-conjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗(上海生工产品)，室温孵育1h，TBST洗涤3遍，每次10min；用ECL显色。WesternBlot分析结果显示，在25KD与35KD之间有一个特异性条带(图8)，与单链抗体TR2-3理论分子量27.5KD大小一致，证明纯化得到的蛋白即为单链抗体TR2-3。实施例8.抗人死亡受体DR5单链抗体对结肠癌、乳腺癌细胞增殖的抑制选用结肠癌细胞COL0205和乳腺癌细胞MDA-MA-231，在37℃、5％CO2的条件下培养至对数期，0.5％胰酶消化细胞后用细胞培养液重悬细胞，并以5.0×104cells/ml的密度接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，在37℃，5％CO2培养箱中培养20h后用2％血清培养基替换原培养基。加入不同浓度的单链抗体，孵育48h，每个浓度设置5个复孔，以不加单链抗体孵育的细胞作为阴性对照；每孔加入10μl的MTT，37℃继续培养4h，弃上清，每孔加入150μlDMSO，在酶标仪570nm波长处测定光吸收值(OD值)。细胞增殖抑制率计算公式如下，细胞抑制率＝(1-(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank))×100％。MTT分析结果显示，单链抗体TR2-3对结肠癌细胞COLO205和乳腺癌细胞MDA-MA-231均有着明显的抑制作用并存在剂量依赖关系(图9)，结果表明，单链抗体TR2-3具有明显的抗肿瘤活性。实施例9.抗人死亡受体DR5单链抗体对结肠癌细胞COLO205caspase通路活化的检测结肠癌细胞COLO205在37℃和5％CO2的条件下培养至对数期，0.5％胰酶消化细胞后用细胞培养液重悬细胞，并以5.0×105cells/孔的密度接种于6孔细胞培养板，500ul/孔，在37℃、5％CO2培养箱中培养20h后用无血清培养基替换原培养基。加入1uM浓度的单链抗体，分别孵育1、2、4h，以未加药物处理的细胞作为阴性对照，标记为0h；药物处理后将细胞从6孔板消化下来，加入适量的RIPA裂解缓冲液冰上裂解30min，12000rpm离心10min，得到的上清液用于SDS-PAGE电泳，4℃，100mA恒流转印2h，将蛋白转印到PVDF膜(Millipore公司产品)；转印结束，将膜置于5％MilkTBST(含有5％脱脂牛奶的TBS)中室温封闭1h；用5％MilkTBST按1∶500稀释抗capase3、caspase8及β-actin抗体(上海生工产品)，室温孵育2h，TBS洗涤3遍，每次10min；用5％MilkTBST按1∶2500稀释HRP-conjugatedGoatAnti-RabbitIgG二抗(上海生工产品)，室温孵育1h，TBS洗涤3遍，每次10min；ECL显色。WesternBlot分析结果显示，caspase3与caspase8均检测到明显的切割条带，且随着单链抗体TR2-3作用时间的延长，切割条带越明显。结果表明，单链抗体TR2-3可以活化caspase通路中关键蛋白caspase3和caspase8(图10)，从而触发细胞凋亡。SEQUENCELISTING<110>中国药科大学<120>一种全人源的抗人死亡受体5的激动剂单链抗体及应用<130>1<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>122<212>PRT<213>Homosapiens<400>1GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyProGlyLeuValLysProSerGlyThrLeuSerLeuThrCysAlaValSerGlyGlySerIleSerSerSerAsnTrpTrpSerTrpValArgGlnProProGlyLysGlyLeuGluTrpIleGlyGluIleTyrHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLysSerArgValThrIleSerValAspLysSerLysAsnGlnPheSerLeuLysLeuSerSerValThrAlaAlaAspThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGlyAlaAlaAlaGlyThrAlaAsnAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrMetValThrValSerSer<210>2<211>108<212>PRT<213>Homosapiens<400>2GluThrThrLeuThrGlnSerProGlyIleLeuSerLeuSerProGlyGluArgAlaSerLeuSerCysArgAlaSerGlnSerValProHisAsnTyrLeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIleTyrGlyAlaSerAsnArgAlaThrGlyIleProAspArgPheSerGlySerGlySerGluThrAspPheThrLeuThrValThrArgLeuAlaProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrGlyArgSerLeuThrPheGlyGlyGlyThrLysValGluIleLysArg<210>3<211>11<212>PRT<213>Homosapiens<400>3GlyGlySerIleSerSerSerAsnTrpTrpSer<210>4<211>16<212>PRT<213>Homosapiens<400>4GluIleTyrHisSerGlySerThrAsnTyrAsnProSerLeuLysSer<210>5<211>15<212>PRT<213>Homosapiens<400>5AlaArgGlyAlaAlaAlaGlyThrAlaAsnAspAlaPheAspIle<210>6<211>7<212>PRT<213>Homosapiens<400>6GlnSerValProHisAsnTyr<210>7<211>7<212>PRT<213>Homosapiens<400>7GlyAlaSerAsnArgAlaThr<210>8<211>8<212>PRT<213>Homosapiens<400>8GlnGlnTyrGlyArgSerLeuThr<210>9<211>15<212>PRT<213>Homosapiens<400>9GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer当前第1页1 2 3