一种双靶点双弹头抗肿瘤融合蛋白、其编码基因和用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药用蛋白技术领域。具体来讲，本发明涉及一种抗肿瘤融合蛋白、其编 码基因、以该融合蛋白为活性成分的药物以及其制药用途。
【背景技术】
[0002] TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱 导配体）是机体自身合成的一种细胞因子，其生理功能主要是调节机体的免疫反应。TRAIL 主要通过细胞外凋亡途径诱导细胞凋亡，但在后期也有线粒体通路的参与。TRAIL信号传导 通路是指以TRAIL为配体，通过与死亡受体结合而启动凋亡信号，最终诱导细胞凋亡。研究 表明，TRAIL及靶向TRAIL受体的激动剂型抗体能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，而正常组 织并不敏感。
[0003] TRAIL对肿瘤细胞具有选择性作用，目前已经发展到II期临床试验阶段，并且预示 了很好的临床应用前景。大量研究已经表明，TRAIL能诱导各种肿瘤细胞凋亡，如肺癌、乳 腺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、中枢神经系统肿瘤、胸腺肿瘤、白血病、多发性骨髓 瘤、黑色素瘤、骨肉瘤等。尽管早期的临床实验是很令人鼓舞的，但是人重组表达的TRAIL (Human recombinant TRAIL, hrTRAIL)仅仅局限于携带TRAIL敏感肿瘤的患者，即使同一 组织来源的肿瘤，对TRAIL的敏感性也有差异。因此，不同肿瘤组织对TRAIL的不敏感性使 TRAIL应用于临床受到限制。然而，研究发现，TRAIL与小分子药物联用后，不但可以克服肿 瘤对TRAIL的耐药性，同时还可以增加疗效。
[0004] 表皮生长因子受体（EGFR)异常表达是多种上皮来源的肿瘤细胞的重要特性，因此 EGFR已成为肿瘤靶向性治疗的理想靶点。EGFR过度表达能够拮抗死亡配体TRAIL和⑶95L 诱导的肿瘤细胞凋亡。如果采用针对EGFR的配体片段融合蛋白拮抗EGFR介导的信号通路， 那么就能增强TRAIL的抗肿瘤作用，并能在一定程度上克服肿瘤细胞对TRAIL的耐药性。
[0005] 力达霉素（LDM)是由1个辅基蛋白（Lidamycin apoprotein, LDP)和1个发色团 (active enediyne chromophore,AE)组成的一种烯二炔类抗肿瘤抗生素，可以作为弹头药 物。其中，辅基蛋白起保护发色团的作用，由110个氨基酸组成，分子量为10506Da，并且这 两个部分可以拆分。研究发现，LDP本身在体内具有中等程度的抗肿瘤作用，并且由于其具 有独特的分子结构，可以作为开发新型抗肿瘤药物的支架载体。
[0006] 基于上述现有技术状况，可以考虑以力达霉素辅基蛋白为支架载体，通过基因工 程的方法将TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白形成融合蛋白。
【发明内容】
[0007] 基于上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种以LDP为支架具有靶向EGFR和 DR4/DR5的双特异性融合蛋白，该融合蛋白为具有抗肿瘤作用的小分子药用蛋白。
[0008] 本发明的另一个目的是提供该融合蛋白的编码基因。
[0009] 由于力达霉素具有可拆分和组装的特性，本发明还提供一种与发色团组装的强化 融合蛋白。
[0010] 本发明的还一个目的是提供以上述融合蛋白为活性成分的药物以及上述融合蛋 白的制药用途。
[0011] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0012] 目前研究表明，TRAIL主要通过与靶细胞表面的特异性受体结合，激活细胞凋亡路 径而发挥其诱导凋亡的作用。有研究表明该机制和EGFR通路在上皮来源的细胞中相互作 用紧密。如果能够拮抗EGFR介导的信号通路，那么就能增强TRAIL的抗肿瘤作用，并且在一 定程度上可逆转肿瘤细胞对TRAIL的耐药性。本研究的目标是构建一种靶向EGFR和DR4/ DR5的双特异性融合蛋白，融合蛋白含有靶向EGFR的配体寡肽，通过拮抗EGFR信号通路来 增加肿瘤细胞对TRAIL的敏感性，逆转肿瘤细胞对TRAIL的天然耐药性。此外，因力达霉素 具有可拆分和组装的特性，本发明人还成功组装了一种新的双靶点强化融和蛋白，该双特 异性强化融合蛋白由三部分组成：两个分别靶向EGFR和DR4/DR5的寡肽配体作为导向分 子，力达霉素作为"弹头"药物，旨在利用导向分子的特异性将力达霉素分子带入肿瘤细胞 中，而且由于配体的靶向性和TRAIL的选择性作用而提高力达霉素对肿瘤细胞的选择性， 从而降低力达霉素的副作用，同时，TRAIL具有靶向和"弹头"的双重作用，希望为抗肿瘤靶 向药物的研制提供一种新的探索。
[0013] 因此，一方面，本发明提供一种抗肿瘤融合蛋白，所述融合蛋白具有以下一级氨基 酸序列结构：
[0014] EGFR特异性把向寡肽-连接肽-力达霉素辅基蛋白-连接肽-TRAIL功能肽段；
[0015] 其中，所述EGFR特异性靶向寡肽具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，共22个氨 基酸；所述力达霉素辅基蛋白具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列，共110个氨基酸；所述 TRAIL功能肽段具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列，共168个氨基酸。在本文中，将具有 上述结构的融合蛋白命名为"Ec-LDP-TRAIL"。
[0016] 在该融合蛋白中，连接肽优选为（GGGGS)2。选择（GGGGS)2作为连接肽的原因在于， 一方面利于在工程菌如大肠杆菌中表达；另一方面，连接肽太短，刚性大，不利于蛋白分子 伸展，容易造成蛋白分子构象相互遮掩，影响蛋白功能，并且力达辅基蛋白（LDP)支架分子 共110个氨基酸，具有a螺旋和0折叠，结构复杂，分子量比较大，因此，选用（GGGGS) 2。
[0017] 所述融合蛋白具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列；或者，所述融合蛋白具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
[0018] 优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:5所示。
[0019] SEQ ID N0:4为本发明提供的一个融合蛋白的氨基酸序列，共320个氨基酸。从 氨基端至羧基端，该融合蛋白包括：EGFR特异性靶向寡肽（Ec)，共22个氨基酸；连接肽，为 (GGGGS) 2柔性肽，共10个氨基酸；力达霉素辅基蛋白（LDP)，共110个氨基酸；连接肽，为 (GGGGS)2柔性肽，共10个氨基酸；TRAIL功能肽段，共168个氨基酸。
[0020] SEQ ID N0:5为本发明提供的一个融合蛋白的氨基酸序列，共330个氨基酸。相比 于SEQ ID N0:4,该融合蛋白在EGFR特异性靶向寡肽之前具有His和Met，在TRAIL功能肽 段的C端具有Leu和Glu以及（His) 6标签。
[0021] 另一方面，本发明提供上述融合蛋白的编码基因。
[0022] 所述编码基因具有SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；或者，所述编码基因具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
[0023] 优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
[0024] 再一方面，本发明提供一种抗肿瘤强化融合蛋白，所述强化融合蛋白为本发明的 上述融合蛋白与力达霉素发色团组装而成，此强化融合蛋白具有TRAIL和力达霉素两个弹 头。
[0025] 根据本发明的【具体实施方式】，所述强化融合蛋白通过包括以下步骤的方法组装而 成：将所述的融合蛋白与力达霉素发色团以1:5的摩尔比混合，于4°C下避光缓慢晃动反应 12~16个小时。反应结束后，去除多余发色团，得到组装成功的强化融合蛋白。根据本发 明的【具体实施方式】，将混合液用ro-10柱(商业化的SephadexG-25柱，Pharmacia产品)层 析分离，经280nm、343nm紫外监测后，弃去过量未反应的AE，收集强化融合蛋白。
[0026] 另一方面，本发明还提供一种抗肿瘤药物，所述药物以本发明提供的上述融合蛋 白和/或强化融合蛋白为活性成分。所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的鳞状上皮 细胞癌；优选地，所述哺乳动物是人。
[0027] 又一方面，本发明还提供上述融合蛋白或强化融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用 途。所述抗肿瘤药物用于治疗或预防哺乳动物的鳞状上皮细胞癌；优选地，所述哺乳动物是 人。
[0028] 综上，本发明应用基因工程的方法提供了一种新型的具有特异性、靶向性的融合 蛋白。该融合蛋白以力达霉素辅基蛋白为支架载体，融合了 TRAIL和EGFR配体寡肽，是靶 向两种受体（EGFR，DR4/DR5)的双特异性融合蛋白。这种双特异性融合蛋白的导向分子为 EGFR寡肽配体和DR4/DR5专一配体的可溶部分（sTRAIL)，且寡肽配体和sTRAIL位于同一 个分子上，使该融合蛋白具有较好的体内外抗肿瘤作用。
[0029] 本发明的优点与积极效果在于，应用基因工程技术制备获得的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL，可特异地与肿瘤细胞表面的EGFR受体和DR4/DR5结合，并能抑制肿瘤细胞 的增殖，在体内也能明显抑制裸鼠移植瘤的生长。此外，融合蛋白均具有较低的药物毒性， 具有发展成肿瘤靶向性治疗药物的潜能。
[0030] 本发明所提供的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL其制备方法包括以下步骤：
[0031] 融合蛋白Ec-LDP-TRAIL重组表达质粒的构建；
[0032] 融合蛋白Ec-LDP-TRAIL在大肠埃