以白介素33为治疗靶点的肿瘤疫苗的制作方法

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体来说是一种以白介素33为治疗靶点的乳腺癌疫苗。

背景技术：

白细胞介素-33是2005年由Schmitz等发现的IL-1家族成员，主要在一些屏障细胞中组成型表达，在细胞坏死或损伤时释放，因此被称为“警报素”。IL-33可与表达在巨噬细胞、DC细胞，NK细胞等Th2细胞表面的ST2受体相结合，激活下游信号通路，调节固有免疫和适应性免疫，另外，在特定的病理条件下，，IL-33还可激活Th1、CD8⁺T细胞等免疫细胞。IL-33在炎症性疾病中具有双重作用，一方面对肥胖和动脉粥样硬化等具有保护作用，另一方面，在哮喘和过敏性疾病中又具有致炎作用。

IL-33在肿瘤免疫中的作用尚不清楚，相关研究认为IL-33可通过抑制固有抗肿瘤免疫，增加瘤内免疫抑制性细胞的数量，来促进肿瘤的发展和转移，研究发现在乳腺癌模型中IL-33可促进髓源性抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞（T-reg）等免疫抑制细胞的在肿瘤组织的浸润，从而促进肿瘤的发展和转移。在胃癌中的研究显示，IL-33可促进胃癌细胞的侵袭和转移。另一方面，有文献指出，在转基因过表达IL-33的B16黑色素瘤和Leiws肺癌小鼠模型中，IL-33可通过增加CD8⁺T细胞和NK细胞的活性，来增加瘤内肿瘤浸润性CTL效应，进而起到抑制肿瘤转移的作用。因此，IL-33可能在不同的肿瘤模型中，不同的肿瘤微环境中具有不同的作用。具体来说，IL-33可能在肿瘤的免疫逃逸和机体的抗肿瘤效应方面起双重作用。一方面通过增加免疫抑制性细胞在肿瘤组织的富集，促进肿瘤的生长和转移，另一方面，通过募集CD8⁺T细胞和NK细胞等免疫细胞的浸润，打破肿瘤微环境的免疫耐受，进而抑制肿瘤的增殖。因此，IL-33在抗肿瘤免疫中的角色及确切机制有待进一步的研究。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率已上升至女性恶性肿瘤第一位，严重威胁女性的生命健康，目前，随着医疗技术的发展，以及放疗、化疗等辅助手段的应用，乳腺癌患者的总体生存率得到极大改善，但是每年还有30%-40%的复发和转移，仍导致患者死亡。临床分离的乳腺肿瘤组织中高表达IL-33，且与肿瘤的发展相关，提示在乳腺癌中，IL-33具有可能的促肿瘤效应。

本发明以HBcAg病毒样颗粒形式呈递IL-33，阐述该重组后的假病毒颗粒的抗肿瘤效力，该重组假病毒颗粒疫苗形式能突破自身的免疫耐受，产生针对自身的抗IL-33的特异性抗体，从而拮抗机体自身的IL-33蛋白水平，下调IL-33，抑制肿瘤生长。

技术实现要素：

以IL33-HBcAg重组病毒样颗粒进行皮下注射,对小鼠进行主动免疫，每隔两周免疫一次，每只100ug,共免疫三次，诱导小鼠产生持续性的IL-33特异的抗体应答，末次免疫后隔两周于小鼠第四脂肪垫原位接种4T1肿瘤细胞，每只1×10⁵cell，第10天成瘤，观察肿瘤生长情况，发现以HBcAg-33病毒样颗粒形式预防性免疫后，小鼠肿瘤生长受到显著抑制，观测时间点结束后，收集免疫后的小鼠脾脏，进行流式检测CTL、Th1/Th2表达水平，ELISPOT检测分泌IFN-γ的淋巴细胞数目，发现疫苗组显著提高了CTL和分泌IFN-γ的淋巴细胞水平。

附图说明

图1显示了免疫记忆的实验程序

图2显示了预防性免疫HBcAg-33疫苗组较载体组显示出较高的IL-33特异性IgG抗体水平。（n=10）

图3显示了疫苗组与载体组的肿瘤生长曲线，预防性免疫HBcAg-33疫苗组，显著抑制了肿瘤的生长。（n=10）

图4显示了疫苗组与载体组小鼠的肺转移情况，预防性免疫HBcAg-33疫苗组没有出现肺部的转移。（n=10）

图5显示了从疫苗组与载体组小鼠体内分离的肿瘤大小情况，疫苗组显著抑制了肿瘤的生长。（n=10）

图6显示了经流式细胞分析，预防性免疫HBcAg-33疫苗组显著提高了CTL的数目。（n=10）

图7显示了经ELISPOT分析，预防性免疫HBcAg-33疫苗组显著提高了分泌IFN-γ的淋巴细胞数目。（n=10）

图8显示了IL-33预防性免疫对Th1/Th2应答偏倚的调控，在肿瘤微环境中，IL-33具有调控Th1应答偏倚的能力。（n=10）

具体实施方式

通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。

实施例

实施例1：HBcAg-33的诱导表达及纯化

HBcAg-33的诱导表达及纯化方法如专利<<主动免疫治疗慢性哮喘的呈递IL-33的VLP疫苗构建方法>>(ZL 2014 1 0248884.2)中所述。按照此方法步骤获得HBcAg-33 VLPs及载体HBcAg VLPs 作为免疫原，进行后续实验。

实施例2：小鼠预防性免疫策略

6-8周的Balb/c雌鼠，随机分为3组，8只/组，分别为疫苗组、载体组和PBS组。免疫形式如图1所示，纯化的HBcAg-33 VLPs、载体HBcAg VLPs、PBS分别在对应组的背部皮下免疫，按每只100ug的注射剂量,隔两周免疫1次，共免疫3次。每一次免疫后一周于小鼠大腿隐静脉采血，检测抗体水平。如图2所示，其中抗体滴度最高可达409600。

实施例3：小鼠乳腺癌原位模型建立：

首先，用含10%FBS,1%青链霉素混合溶液的RPMI-1640培养基中，于37℃，5%CO₂培养箱中培养4T1肿瘤细胞，末次免疫后隔两周于小鼠腹部第四脂肪垫注射4T1肿瘤细胞，每只1×10⁵cell,第10天成瘤，每隔两天测量肿瘤，绘制肿瘤生长曲线，监测肿瘤生长如图3所示。

实施例4：模型干预

监测肿瘤生长至13mm左右，在小鼠处于麻醉状态时，心脏取血，使小鼠安乐死，分离血清，并借助流质针经气管用1ml印第安墨水灌肺染色5分钟，然后取出肺脏并在含70%乙醇、10%福尔马林、5%乙酸的脱色中进行脱色处理，由于肿瘤结节不吸收墨水而呈现白色，并记录肺转移结节数目。统计结果如图4所示。

实施例5：流式细胞检测

无菌条件下从小鼠体内分离肿瘤和脾脏，各免疫组的肿瘤大小如图5所示，应用小鼠淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞，经PMA及离子霉素刺激后，分别进行Th1/Th2、CTL的表面及胞内分子的染色（达科为），此步骤按说明书进行，标记完成后于流式细胞仪上进行检测。统计结果如图6所示。

实施例6：ELISPOT分析

从小鼠体内分离的淋巴细胞，应用ELISPOT试剂盒达科为检测分泌IFN-r的总淋巴细胞数目，分离的脾脏淋巴细胞按3×10⁵个细胞数目铺至96孔细胞培养板中，应用阳性刺激物体外刺激，于37℃ ，5% CO₂培养箱中培养16-20h。操作步骤按照说明书进行。统计结果如图7所示。

实施例7:IgG抗体亚型检测

取分离的小鼠全血血清，ELISA检测IL-33对IgG₁和IgG_2a抗体亚型的调控。以实验室制备的HBcAg包被酶标板，50µl/孔，于湿盒中4℃过夜，用PBST（含5%的Tween20的PBS，pH7.2）洗涤3次，加入含5%BSA的PBST室温封闭2h，PBST洗涤3次，加入小鼠血清或组织灌洗液，室温下孵育1h，PBST洗3次，再加入生物素标记的抗小鼠IgA、IgG₁与IgG_2a（1：10000稀释），最后，加入亲和素-碱性磷酸酶（1：10000稀释），洗涤后加入碱性磷酸酶底物溶液，30min后，在酶标仪测OD₄₀₅值，然后计算IgG₁与IgG_2a的比值结果如图8所示。