专利名称：一种整合素介导的肿瘤双重靶向脂质体及其制备方法
技术领域：
本发明属于药物剂型和制剂技术领域，特别涉及一种供注射用的载抗癌药物 的靶向性给药系统。同时用聚乙二醇(PEG)和含苯丙氨酸-组氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-天冬酰胺(PHSCN)序列的整合素配体将脂质体的表面进行修饰，修饰 后的脂质体可以将抗癌药物同时靶向传输到肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞 内，从而增强肿瘤治疗效果。
背景技术：
恶性肿瘤一直是困扰人类的重要疾病，目前尚无治愈癌症的方法。对于恶性 实体瘤的传统疗法为手术切除肿瘤后再用抗肿瘤药物进行化疗。大部分的化疗药 物没有选择性，这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常的细胞产生杀伤作 用，因此会产生严重的副作用，如阿霉素的心脏毒性作用等。将抗肿瘤药物用脂 质体进行包载后可以明显延长其在体内循环的时间，有利于抗肿瘤药物向肿瘤区 蓄积，从而增加了抗癌药物的治疗指数，即增加疗效，减少了毒副作用。目前已 有阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体、紫杉醇脂质体等产品上市。普通脂质体虽然能够改善抗癌药物的疗效，但由于其易被肝脏、脾脏内的巨 噬细胞摄取而迅速消除，药物在体内滞留时间短。普通脂质体的表面进一步用亲 水性的聚乙二醇(PEG)进行修饰，可制成长循环脂质体。长循环脂质体能够逃 避血浆中的调理素的调理从而避免了被巨噬细胞摄取(故也称为隐性脂质体)， 显著延长了其在循环系统中的滞留时间，血药浓度也明显提高。长循环脂质体经 增强滞留和渗透作用(EPR)可增加被包载药物向肿瘤组织内的蓄积，从而提高 了抗癌药物传递的靶向性。目前已有阿霉素隐性脂质体上市(DOXIL⑧， CAELYX )。长循环脂质体能够延长药物在体内的循环时间，增强抗肿瘤药物向肿瘤内的 蓄积，但并不意味着一定能够提高抗肿瘤药物的疗效。其原因之一在于大部分抗 肿瘤药物的靶点中位于细胞核内，药物必须克服细胞膜这一屏障进入到细胞内才 能发挥作用。脂质体包封的药物进入细胞内主要有三种途径，即扩散，膜融合以 及被肿瘤细胞吞噬。如果包封在脂质体双分子膜内的药物不能够释放到细胞间质中，那么通过扩散途径进入肿瘤细胞内的药物会受到限制。由于大部分的脂质体 材料不能与细胞膜进行融合，故经膜融合方式进入到细胞内的药物也有限。许多 试验证明，普通的隐性脂质体不能经细胞吞噬作用进入到肿瘤细胞，所以长循环 脂质体尽管能够增加肿瘤组织中的浓度，但疗效却不一定有所增加。由于通过增 加扩散和膜融合的方式来增加抗肿瘤药物向细胞内的转运有很多局限性，用配体 修饰长循环脂质体就成为提高抗癌药物靶向性的重要手段。国外有学者用叶酸， 转铁蛋白以及单克隆抗体来修饰隐性脂质体用以增加药物肿瘤细胞内传递的耙 向性，动物试验证明能够提高抗癌药物的疗效，相关产品有的已进入临床研究。 肿瘤的生长、侵袭和转移都依赖于新生血管的形成。当肿瘤体积大于2mm3 时，其继续生长依赖于肿瘤新生血管为其提供营养和氧气，并为其血行扩散和远 处转移提供途径。封闭和抑制肿瘤新生血管，切断肿瘤的营养和氧气供应，对于 肿瘤治疗是一个有效的治疗策略。因此，以肿瘤血管为耙的治疗已经成为肿瘤治 疗领域的一个重要组成部分。与传统的以肿瘤细胞为靶的化疗相比，肿瘤血管耙向治疗具有许多优势(1)内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。(2)内皮细胞比肿瘤细胞对化疗药物更敏感，药物剂量小，从而可以降低药物毒副作用。(3) —根微血管可以维持数以万计的肿瘤细胞的生长，治疗效率高。(4)肿 瘤血管内皮细胞其表面一般均一地、高度地表达大量特异性受体，有利于肿瘤治 疗的选择性。中国发明专利(20051006338.0， 2008101345812.2)，涉及供注射用的载抗 癌药物的长循环脂质体，其特征在于脂质体同时用PEG链和含RGD序列的线性多 肽或含RGD类似物的线性片段修饰。研究表明，这种新型载体的确可以在一定 程度上增加肿瘤细胞内药物的浓度，提高抗肿瘤效果。RGD类寡肽修饰的脂质体主要针对肿瘤细胞和新生血管内皮细胞表面高度 的整合素0^3和O^5。近年来，a5^在新生血管生成中受到了越来越多的重视。基 因学实验研究表明，血管发生和新生血管形成更多的依赖于纤维粘连蛋白FN和 其主要受体a5/3p而不是 类整合素。a5/3i与其配体的结合，不仅可以直接诱导 血管新生，而且还可以增加o^3诱导的血管新生效应。相对于其它亚型，整合素 a5^表达特异性更高，只在新生血管处高表达，而在静止的血管内皮基本不表达。 PHSCN是从纤维粘连蛋白的协同结构域PHSRN衍生的一种a5^拮抗剂，其不仅可以和纯化的a5/3,、 cg33和ov(35结合，也可以与表达整合素的肿瘤细胞和多种血管 内皮细胞结合。基于上述背景，我们设计了一种新的药物组合物，将脂质体同时用PEG和 含PHSCN序列的线性肽修饰，PEG修饰的长循环脂质体能通过增强渗透和滞留 作用向肿瘤组织内蓄积，积蓄在肿瘤组织内的脂质体，其肿瘤新生血管内皮细胞 表面和肿瘤细胞所表达的多种整合素所识别，粘附在细胞表面，经内吞作用进入 到肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细胞内。达到双重靶向，实现双重治疗肿瘤作用。 发明内容本发明的目的在于提供一种整合素受体介导的肿瘤双重靶向长循环脂质体组合物，其组成为 抗肿瘤药物，具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞耙向功能的多肽，聚乙二醇或其衍生物，制备脂质体药物的载体。它们的重量百分组成为抗肿瘤药物，0.1%-30%具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞靶向功能的多肽，0.01%-10% 聚乙二醇或其衍生物，0.01%-20% 制备脂质体药物的载体，40%-99.88%。聚乙二醇修饰的脂质体能够显著延长脂质体在体内的循环时间，有利于脂质 体在肿瘤部位的被动蓄积。含PHSCN序列的线性多肽连接在PEG链的末端， 避免了 PEG链对配体受体识别的干扰，使之能够更好地和肿瘤部位的受体结合， 从而促进包封在脂质体的抗癌药物主动转运到肿瘤新生血管内皮细胞和肿瘤细 胞内。本发明所说的具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞靶向功能的多肽片段是含 苯丙氨酸-组氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-天冬酰胺(縮写为PHSCN)序列的任何线性 多肽片段，如含PHSCN序列的五肽、六肽、七肽、八肽、九肽和 十肽。所选 片段应易于和修饰在脂质体表面，并不影响PHSCN序列的活性基团巯基。具体有Ac-PHSCN-NH2. Ac-PHSCNK-NH2, PHSCN， Ac-PHSCNGGK-NH2等，其中优选的为Ac-PHSCN-NH2 。本发明所说的聚乙二醇(PEG)其分子量为200-5000，优选的为2000-3000。 聚乙二醇的衍生物，优选如聚乙二醇(PEG)的二醛衍生物OHC-PEG-CHO。本发明所说的组合物中，所述的脂质体是指，主要以磷脂(至少包括一种乙 醇胺类磷脂)和胆固醇为材料所制成的脂质体双分子囊泡。因此本发明所述制备脂质体药物的载体主要为磷脂和胆固醇，其中磷脂包括 大豆磷脂(SPC)， 二月桂酰卵磷脂(DLPC)、 二肉豆蔻酰卵磷脂(DMPC)、 二 棕榈酰卵磷脂(DPPC)、 二硬脂酰卵磷脂(DPPC)、 二硬脂酰卵磷脂(DSPC)、 l-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂(MPPC)、 l-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂(PMPC)、 l-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂(PSPC)、 l-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂(SPPC)、蛋黄卵 磷脂(EPC)、氢化豆磷脂(HSPC)、 二油酰基卵磷脂(DOPC)、 二月桂酰磷脂 酰甘油(DLPG)、 二棕榈脂酰甘油(DPPG)、 二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、 二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、 二肉豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、 二棕榈酰磷脂酸 (DPPA)、 二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、 二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、 二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸(DPPS)、脑磷 脂酰丝氨酸(PS)、脑神经鞘磷脂(BSP)、 二棕榈酰神经鞘磷脂(DPSP)、 二硬 脂酰神经鞘磷脂(DSSP)、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)之一种或一种以上 者。本发明所述的脂质体主要以磷脂和胆固醇组成，其中磷脂总量与胆固醇的比例为1-1000: 1，优选为1-10: 1。本发明所说的被包封的药物包括阿霉素、环磷酰胺、放线菌素、博来霉素、 正定霉素、表阿霉素、丝裂霉素、甲氨喋昤、柔红霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、柔红霉素、5-氟脲嘧啶、卡铂、顺铂、卡氮芥、龟臼乙叉 甙、干扰素、长春碱、长春新碱、三苯氧胺以及相应的盐类。本发明的脂质体的制备方法如下(1) 先合成聚乙二醇(PEG)的二醛衍生物(OHC-PEG-CHO)，用于连接 含PHSCN序列的肽片断到脂质体表面。(2) 取磷脂(如HSPC和DPPE)、胆固醇、OHC-PEG-CHO作为制备脂质 体的原料，置圆底烧瓶中，加入有机溶剂溶解后，按常规方法制备即可得到空白长循环脂质体。取含PHSCN序列的肽溶液若干，加入到空白脂质体中，常温或 37'C孵育l-2小时，采用适当的方法除去未偶联的肽。抗癌药物(如阿霉素)可 在配体修饰前或修饰后装载到已制备好的脂质体。 本发明的优点本发明用含PHSCN序列的线性多肽修饰的长循环脂质体作为抗肿瘤药物的 载体，进一步提高了抗肿瘤药物的治疗指数。本发明所述脂质体所用的含PHSCN序列的多肽，由于分子量小，因而抗原 性较小，不易发生免疫反应；含PHSCN序列的多肽可与纯化的整合素c^、 avft 以及表达这些整合素的内皮细胞和肿瘤细胞结合。本发明中，用含PHSCN序列 的多肽修饰的脂质体已被证实能够主动转运进入人脐静脉内皮细胞、鼠黑色素瘤 B16F10细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞内。本发明与己报道的用整合素avft特异性的多肽如RGD修饰的脂质体作为抗 癌药物的载体不同之处在于两种肽的种类不同，作用机制也不相同。PHSCN为 整合素与其配体结合的协同片段PHSRN的衍生物，RGD多肽修饰的脂质体主要 靶向整合素cM33，而PHSCN多肽修饰的脂质体主要耙向整合素a5/^。近年来， 在新生血管生成中受到了越来越多的重视。基因学实验研究表明，血管发生和新 生血管形成更多的依赖于纤维粘连蛋白FN和其主要受体a5i8p而不是 类整合 素，因而整合素a5/^相对于其它亚型，表达特异性更高，只在新生血管处高表达， 而在静止的血管内皮基本不表达。本发明的PEG的长循环作用也已被证明切实有效。本法生产简单，条件温和，通过OHC-PEG-CHO进行偶联，即可实现脂质 体的PEG化，然后通过孵育将配体修饰在脂质体表面，适于大工业生产。通过研究已证实，本发明的脂质体在体外对肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞具 有明显的选择性，在体内可以显著抑制肿瘤的生长，并延长小鼠的生存时间。
图1 、 PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体(PHSCNK-PL-DOX)的结构。 图2、尾静脉注射阿霉素溶液(Free DOX)、阿霉素长循环脂质体(PL-DOX)、 和PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体(PHSCNK-PL-DOX)后的血药浓度曲 线。其中PHSCNK代表乙酰基-苯丙氨酸-组氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-酰胺基。图3、尾静脉注射阿霉素溶液(Free DOX)、阿霉素长循环脂质体(PL-DOX)、 和PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体(PHSCNK-PL-DOX)后的肿瘤组织阿霉素浓度曲线。图4、尾静脉注射生理盐水(Saline)、阿霉素溶液(Free DOX)、阿霉素 长循环脂质体(PL-DOX)、和PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体 (PHSCNK-PL-DOX)后的小鼠肿瘤生长曲线。图5、尾静脉注射生理盐水(Saline)、阿霉素溶液(Free DOX)、阿霉素 长循环脂质体(PL-DOX)、和PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体 (PHSCNK-PL-DOX)后的小鼠的存活率曲线。
具体实施方式
通过以下实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。 实施例1、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置75i: 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得至ljPHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。脂质体结构见附图l。本发明制备的阿霉素脂质体PL-DOX和PHSCNK-PL-DOX基本理化性质见表l:制剂平均粒径(nm)PDI表面电位(mV)PL-DOX95.4±2.50.114士0.01-2.12±0.9PHSCNK- PL-DOX96.0±3.10.128±0.01-3.34±0.5实施例2、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的体外细胞靶向性评价
采用激光共聚焦试验考察细胞对阿霉素的摄取以及阿霉素在细胞内的分布 情况。将人脐静脉内皮细胞或黑色素瘤细胞分别与PL-DOX和PHSCNK-PL-DOX 置C02培养箱中孵育2小时，依次用冷PBS缓冲液漂洗3次，组织细胞固定液固定， 然后用Hoechst 33258进行细胞核染色10min， PBS漂洗3次后用PBS封片，避光冷 藏，用激光共聚焦显微镜测定。实验结果表明，PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂 质体能够显著增加内皮细胞和肿瘤细胞对药物的摄取。
实施例3、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的药动学以及在肿瘤组织 中的分布
由于本发明结合了长循环脂质体技术和促进细胞内转运的方法来提高抗癌 药物的疗效，要求其具备长长循环脂质体的特征，即延缓药物在血浆中的清除以 及向肿瘤组织和肿瘤细胞内的转运。本实施例以接种黑色素瘤B1610的C57BL/6 小鼠为动物模型，尾静脉注射阿霉素制剂后的实验结果。 参比制剂阿霉素长循环脂质体，游离阿霉素溶液。 试验制剂包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体。 试验动物接种鼠源性的黑色素瘤B16F10的C57BL/6小鼠，体重18-22克， 待肿瘤长到lcm、寸，尾静脉注射给药，给药剂量为6mg/kg，每个时间点3-5只。
试验结果血药浓度以及肿瘤中药物浓度随时间的变化数据分别见附图2和 附图3。
实验结果表明，游离阿霉素尾静脉注射后迅速从循环系统中清除，0.5小时 后，血浆中阿霉素浓度检测不到。与游离阿霉素相比，阿霉素长循环脂质体和 PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体均能够在血液循环中维持较长的时间，并且 能够在肿瘤组织中蓄积，其血浆AUC分别为439.4和233.0hr^g/mL。游离阿霉素、 阿霉素长循环脂质体和PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体的肿瘤AUC分别为 63.4、 91.4和79.3h卞g/g。
实施例4、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的药效学
参比制剂阿霉素长循环脂质体，游离阿霉素溶液。
试验制剂包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体。试验动物接种鼠源性的黑色素瘤B16F10的C57BL/6小鼠，体重18 — 22克， 接种24小时后，尾静脉注射给药， 一周三次，给药剂量为1.25mg/kg，共给药六 次，每组6只小鼠，考察指标为肿瘤生长抑制和小鼠存活率。
试验结果肿瘤抑制试验结果见附图4，小鼠生存曲线见附图5。 结果表明，PHSCNK修饰的阿霉素长循环脂质体能够明显抑制肿瘤的生长 并延长荷瘤小鼠的存活率。
实施例5、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩
尔比为20: 5: 5: 20)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声
溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适
量硫酸铵溶液(123mM, pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C, 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例6、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩
尔比为20: 10: 10: 20)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超
声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取
适量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱 落，水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷 酸盐缓冲盐(PBS, pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置 65'C水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000 修饰的阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的 PL-DOX溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的 阿霉素脂质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例7、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备取大豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔
比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶 解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量 硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7，4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例8、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取卵磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔比
为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶解
后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量硫
酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落，水 浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐缓 冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C水 浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的阿 霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX溶 液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂质 体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例9、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩
尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声
溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适
量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS, pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置75'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)
实施例IO、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔比
为20: 5: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1),超声溶解
后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量硫
酸铵溶液(123mM, pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落，水 浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐缓 冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C水 浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的阿 霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX溶 液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂质 体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例ll、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔
比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶 解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量 硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例12、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO
(摩尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，
超声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全 脱落，水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用 磷酸盐缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体 置75'C水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000 修饰的阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的 PL-DOX溶液，滴加完毕后，37°C， 2000卬m，孵育2小时，得歪lJPHSCNK修饰的 阿霉素脂质体(PHSCNK-PL-DOX)
实施例13、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取卵磷脂、胆固醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔
比为20: 5: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶
解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量
硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C, 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例14、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取大豆磷脂、胆固醇、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩
尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1),超声
溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适
量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65。C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。实施例15、包载阿霉素的PHSCNGGK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩
尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声
溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适
量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置75i: 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG修饰的阿霉 素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX溶液， 滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂质体 (PHSCNK孔-DOX)。
实施例16、包载阿霉素的PHSCNGGK修饰的长循环脂质体的制备
取卵磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔比
为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶解
后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量硫
酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落，水 浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐缓 冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65r水 浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的阿 霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX溶 液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂质 体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例17、包载阿霉素的PHSCNGGK修饰的长循环脂质体的制备
取大豆磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO (摩尔
比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶
解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量
硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置65'C水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例18、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG3500-CHO (摩
尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声
溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适
量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置75'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)
实施例19、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、OHC-PEG2000-CHO (摩尔比为15: 10: 5: 1: 10)，置于圆底烧瓶 中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去
有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入 到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落，水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得 的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集 脂质体部分，将收集到的空白脂质体置75t:水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育 IO分钟，并时时振荡，得到PEG2000修饰的阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK 储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm, 孵育2小时，得到PHSCNK修饰的阿霉素脂质体(PHSCNK-PL-DOX) 实施例20、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(摩尔比为15: 10: 5: 1)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10:1)，超声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。 吸取适量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完 全脱落，水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱， 用磷酸盐缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质 体置75"水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG2000 修饰的阿霉素脂质体(PL-DOX)。取OHC-PEG2000-CHO适量用蒸馏水溶解后， 缓慢滴加到纯化的PL-DOX溶液中，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时， 然后在PBS (pH7.4)中4"C透析24小时除去过量的OHC-PEG2000-CHO。取 PHSCNK储备液适量，缓慢加入到上述脂质体溶液中，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得至!jPHSCNK修饰的阿霉素脂质体(PHSCNK-PL-DOX) 实施例21、包载紫衫醇(PTX)的PHSCNGGK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO、紫
衫醇(摩尔比为15: 10: 5: 10: 0.5)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇 (10: 1)，超声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透
明薄膜。加入0.02M的Tris-HC暖冲液(pH7.0，含0.15M的NaCl)，旋转摇动圆底烧 瓶，得到脂质体悬液。用氮气冲洗后，封口室温平衡l天，水浴超声处理至出现 淡蓝色乳光，然后再用5.4%葡萄糖溶液透析除盐，得到PEG修饰的紫衫醇脂质体 (PL-PTX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-PTX溶液，滴加完 毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的紫衫醇脂质体 实施例22、包载多烯紫衫醇(DTX)的PHSCNGGK修饰的长循环脂质体的制备 取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO、多
烯紫衫醇(摩尔比为15: 10: 5: 10: 0.5)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿 甲醇(10: 1)，超声溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀
的透明薄膜。加入0.02M的Tris-HCl缓冲液(pH7.0，含0.15M的NaCl)，旋转摇动圆 底烧瓶，得到脂质体悬液。用氮气冲洗后，封口室温平衡l天，水浴超声处理至 出现淡蓝色乳光，然后再用5.4%葡萄糖溶液透析除盐，得到PEG修饰的紫衫醇脂 质体(PL-DTX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-PTX溶液，滴 加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的多烯紫衫醇脂质体 实施例23、包载顺铂(CDDP)的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备取顺铂溶于0.9%的氯化钠溶液中，浓度为8.5mg/ml，至45"C的水浴中温育1 小时。取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG2000-CHO(摩
尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量乙醇，超声溶解后，然后加
入到上述药物的溶液中。使所得混合溶液中脂材的最终浓度为150mg/ml，乙醇 的浓度为10%。将溶液温度在75'C条件下持续搅拌1小时，并在65'C条件下挤压 过200nm的聚碳酯膜ll次，最后过100nm的聚碳膜。将制得的脂质体放冷至室温， 在冷却过程中，有深黄色的沉淀形成，弃去上清液，将样品在室温下静置更长时 间，再收集上清液，如此反复。最后将样品稀释2倍后用含有lmM氯化钠10。/。蔗 糖溶液透析直至溶液达到平衡，得到PEG修饰的顺铂脂质体(PL-CDDP)。取 PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-CDDP溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得到PHSCNK修饰的多烯紫衫醇脂质体 实施例24、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备
取氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、OHC-PEG3500-CHO (摩
尔比为15: 10: 5: 10)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿甲醇(10: 1)，超声
溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使成均匀的透明薄膜。吸取适
量硫酸铵溶液(123mM， pH5.4)加入到圆底烧瓶中，涡旋振荡使脂膜完全脱落， 水浴超声至出现淡蓝色乳光。将制得的空白脂质体过SephadexG50柱，用磷酸盐 缓冲盐(PBS， pH7.4)洗脱，收集脂质体部分，将收集到的空白脂质体置75'C 水浴中预热，加入阿霉素储备液孵育10分钟，并时时振荡，得到PEG3500修饰的 阿霉素脂质体(PL-DOX)。取PHSCNK储备液适量，缓慢加入到纯化的PL-DOX 溶液，滴加完毕后，37°C， 2000rpm，孵育2小时，得至IJPHSCNK修饰的阿霉素脂 质体(PHSCNK-PL-DOX)。
实施例25、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备 组分阿霉素重量百分比0.1%， PHSCNKO.01% ， OHC-PEG3500-CHO0.01%
氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺99.88%，制备方法同实施例24。 实施例26、包载阿霉素的PHSCNK修饰的长循环脂质体的制备 组分阿霉素重量百分比30%， PHSCNK10。/。 ， OHC-PEG3500-CHO 20% 氢化豆磷脂、胆固醇、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺40%，制备方法同实施例24。
权利要求
1、一种装载抗癌药物的长循环脂质体组合物，其特征在于，其重量百分组成为抗肿瘤药物，0.1％-30％具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞靶向功能的多肽，0.01％-10％聚乙二醇或其衍生物，0.01％-20％制备脂质体药物的载体，40％-99.88％。
2、 如权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于，所述聚乙二醇选自分子量 在200-50000之间的聚乙二醇，所述聚乙二醇衍生物，选自聚乙二醇的二醛衍 生物OHC-PEG-CHO。
3、 如权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于，所述具有肿瘤新生血管耙向和肿瘤细胞靶向功能的多肽是含有rascN的线性肽或与其结构类似的化合物。
4、 如权利要求3所述的脂质体组合物,其特征在于所述含有PHSCN的线性肽， 是氨基端乙酰化和羧基端酰胺化的五肽、六肽、七肽、八肽、九肽或十肽。
5、 如权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于，所述含有PHSCN的线性 肽选自Ac-PHSCN-NH2. Ac-PHSCNK-NH2. PHSCN， Ac-PHSCNGGK-NH2等 其中优选的为Ac-PHSCN-NH2其中优选的为Ac-PHSCN-NH2。
6、 如权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物选自阿 霉素、环磷酰胺、放线菌素、博来霉素、正定霉素、表阿霉素、丝裂霉素、甲氨 喋呤、柔红霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、柔红霉素、5-氟脲嘧啶、卡铂、顺铂、卡氮芥、龟臼乙叉甙、干扰素、长春碱、长春新碱、三 苯氧胺以及相应的盐类。
7、 如权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于，所述脂质体组合物是注射 给药的药物制剂形式。
8、 如权利要求l所述的脂质体组合物，其特征在于，所述脂质体表面多肽的连 接方法是将含苯丙氨酸-组氨酸-半胱氯酸-丝氨酸-天冬酰胺序列的任何线性肽连 到聚乙二醇末端，或直接连接到脂质体的表面。
9、 如权利要求1所述的脂质体组合物，其特征在于，所述脂质体是以磷脂和胆 固醇为材料制成的脂质双分子层囊泡，其中磷脂总量与胆固醇的比例1-1000: 1;所述制备脂质体药物的载体主要为磷脂和胆固醇，其中磷脂选自大豆磷脂、二 月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二硬脂 酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、l-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈 酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、二 油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、 二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙 醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰磷脂 酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰 神经鞘磷脂或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之一种或一种以上者。
10、如权利要求1所述的脂质体组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 将磷脂、胆固醇、聚乙二醇的二醛衍生物作为制备脂质体的原料，用有机溶剂溶 解后，按脂质体制备的常规方法，制备长循环脂质体，然后将具有肿瘤新生血管 耙向和肿瘤细胞耙向功能的多肽加入长循环脂质体中；并加入抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明提供一种整合素介导的肿瘤双重靶向脂质体及其制备方法，本发明的组合物，其组成为抗肿瘤药物，具有肿瘤新生血管靶向和肿瘤细胞靶向功能的多肽，聚乙二醇或其衍生物和制备脂质体药物的载体。
文档编号A61K9/127GK101653416SQ200910176039
公开日2010年2月24日 申请日期2009年9月22日 优先权日2009年9月22日
发明者代文兵, 强 张, 烜 张, 王坚成 申请人:北京大学