用于抑制消化道肿瘤干细胞增殖、分化和干性诱导的药物的制作方法

本发明属于药物技术领域，具体涉及用于抑制消化道肿瘤干细胞增殖、分化和干性诱导的药物。

背景技术：

随着对肿瘤异质性研究的深入，传统的克隆演进学说受到新兴肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）学说的挑战。CSCs学说认为肿瘤组织是由处于不同分化层级的肿瘤细胞组成的，其中CSCs位于肿瘤细胞群体的顶端，能仅以10-100个细胞即可在宿主体内形成一个与人体肿瘤性质相同的肿瘤，是造成肿瘤的异质性的根本所在。2006年，美国癌症研究协会定义CSCs为存在于肿瘤中的一小群具有自我更新、多向分化潜能及高致瘤性的肿瘤细胞，也称肿瘤起始细胞（tumor initiating cells，TICs）。至今为止，已在白血病、胶质瘤、乳腺癌、结直肠癌和肺癌等多种肿瘤中分离鉴定出CSCs。愈来愈多的实验证据表明，CSCs除具有自我更新、多向分化和高致瘤特性外，也是肿瘤血管生成、耐药、侵袭、转移及复发的根本所在。临床常规的化疗药物，如顺铂、环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、卡培他滨等，虽然能杀死肿瘤组织中大多数亚型的肿瘤细胞，但对CSCs的抑制或杀死作用则非常有限，甚至会诱导部分肿瘤亚型细胞干性增强，从而导致肿瘤耐药、复发及转移。因此，靶向CSCs的诊断和治疗，有望成为完全防治肿瘤的新途径，已成为肿瘤研究领域的前沿和热点。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于抑制消化道肿瘤干细胞增殖、分化和干性诱导的药物的技术方案。

所述的用于抑制消化道肿瘤干细胞增殖、分化和干性诱导的药物，其特征在于含有有效成分小檗碱。

所述的药物，其特征在于所述的消化道肿瘤干细胞包括胃癌干细胞、结肠癌干细胞和肝癌干细胞。

所述的药物，其特征在于该药物为原型药或其药学上可接受的盐。

所述的小檗碱在制备抑制消化道肿瘤干细胞增殖、分化和干性诱导的药物中的应用。

所述的应用，其特征在于所述的消化道肿瘤干细胞包括胃癌干细胞、结肠癌干细胞和肝癌干细胞。

所述的小檗碱在增加常规化疗药对消化道肿瘤干细胞的疗效和减少常规化疗药对消化道肿瘤干细胞的耐药性中的应用。

所述的小檗碱在减少常规化疗药引起的消化道肿瘤干细胞干性增强中的应用。

所述的一种增加常规化疗药对消化道肿瘤干细胞的疗效和减少常规化疗药对消化道肿瘤干细胞的耐药性的药物，其特征在于含有小檗碱和化学化疗药。

所述的一种减少常规化疗药引起的消化道肿瘤干细胞干性增强的药物，其特征在于含有小檗碱和化学化疗药。

本发明一方面提供了一种抑制消化道肿瘤干细胞增殖、分化和干性诱导的药物，该药物能够抑制消化道肿瘤干细胞的增值、转移和分化，并且该药物能够减少常规化疗药物所引起的肿瘤细胞干性化；本发明另一方面提供了小檗碱的一种新用途。

附图说明

图1为荧光定量 PCR 检测各肿瘤细胞及其干细胞中干性基因的表达；

图2 为小檗碱和顺铂对原代肿瘤细胞及其肿瘤干细胞的抑制作用；

图3为小檗碱对肿瘤干细胞的诱导凋亡作用；

图4为小檗碱对裸鼠皮下肿瘤组织生长的抑制作用；

图5为小檗碱对荷瘤裸鼠体重变化的影响；

图6为小檗碱对裸鼠皮下肿瘤组织中相关基因表达的影响；

图7 为小檗碱对肿瘤干细胞化疗敏感性的作用。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1 肿瘤干细胞的分离鉴定

人胃腺癌细胞系 SGC7901、MKN28；人结肠癌HT29、SW620；人肝癌细胞系Huh7、SMMC-7721，使用本实验室细胞冻存库。

本研究采用国际常用的无血清饥饿培养法，从现有细胞系中分离、富集肿瘤干细胞。具体操作如下：分别取对数生长期的上述各类型的癌细胞，经胰酶消化，分别制成单细胞悬液，使用 PBS 洗涤离心去除残留的血清后，作细胞计数，取 2 万个细胞接种于 10 cm 超低粘附培养皿中，添加含 B27（1×）及 EGF 5ng/ml 的 DMEM/F12 培养基 10 ml，培养 3-5 天，即可见有细胞球生长，为第一代肿瘤干细胞球；每隔 5 天对细胞球进行传代，用移液器吹打细胞球以求吹散细胞球，注意操作轻柔，尽量吹打成单个细胞；离心收集细胞球，按 1:3 比例传代接种于 DMEM/F12 干细胞培养基，继续培养扩增，到 10-14 天时，吹打细胞球成单细胞，离心后接种于含 10% FBS 的完全培养基中，贴壁 1h，去除没有贴壁的凋亡细胞，使用贴壁细胞进行后续实验。

分别取各类型肿瘤干细胞适量，提取总RNA，进行cDNA合成，PCR 反应条件如下：

a．定量引物：

b．定量反应程序

反应体系：cDNA 1μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、2xSYBR mix 10μl、水8μl，总量为20μl。

反应程序：

预变性 95℃ 1min，变性 95℃ 10sec，退火55℃ 10sec，延伸 72℃ 30sec，40 个循环。在循环结束后立即进行融解曲线测定，检测温度为 65℃-95℃，升温速率为 0.5℃/sec，恒温时间为 1sec/次。

经无血清饥饿培养法，大部分肿瘤细胞死亡，少数细胞团抱成球生长；收集细胞球（即为肿瘤干细胞CSC），按 1:3 比例传代接种于 DMEM/F12 干细胞培养基，继续培养扩增至所需实验数量。采用荧光定量PCR技术，比较CSC和原代细胞系细胞中的干性相关转录因子Klf4、Oct4、NANOG、Sox2 以及干性相关基因 Bmi-1 的表达。结果如图1显示，各细胞系诱导的肿瘤干细胞中Klf4、Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1的表达均显著高于原代细胞系的表达，证明这些细胞球具有干细胞特性。

根据干性基因表达鉴定结果，选取干性基因表达最高的第三代诱导细胞球(CSC-3)，轻轻吹打制备成单细胞悬液，用无血清培养液稀释细胞至200ul 中含所需细胞数(见表1)，用无菌注射器将 200μl 细胞悬液接种于 4～6 周龄裸鼠腋下或者腹股沟(裸鼠均为雄性)，饲养于标准无菌条件的 ICU 单元，每隔 3-5 天观察动物生长及成瘤情况。

实验结果如表1所示，在裸鼠体内 1×10⁴-5×10⁴个肿瘤干细胞即可引起肿瘤的发生；而原代肿瘤细胞需在5×10⁶个细胞数目的条件下接种，才能引起小鼠皮下肿瘤生长。证明本实验诱导的肿瘤干细胞比原代肿瘤细胞具有更强的致癌特性。

表1裸鼠皮下移植不同肿瘤细胞数的成瘤情况

注：- 表示未检测；m/n，m表示成瘤的裸鼠数量，n表示用于实验的裸鼠数量。

实施例2 小檗碱对原代肿瘤细胞及其肿瘤干细胞的体外抑制作用

选用对数生长期的贴壁肿瘤干细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培养基配成50000个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100 μl，37℃，5％CO2培养24 h。实验组加入含不同浓度药物的无血清培养基，对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设3-6个平行孔，37℃，5％CO2培养48h。每孔加入20 μl新鲜配制的含0.2 mg/ml MTT的无血清培养基，37℃继续培养4 h。小心吸去上清，并加入150 μl DMSO，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上以试验波长为570 nm，参比波长为450 nm测定光密度值。

图2结果所示，在同等给药剂量（50μM）下, 小檗碱无论是对原代肿瘤细胞，还是对肿瘤干细胞体外增殖的抑制作用均明显高于顺铂；而顺铂对肿瘤干细胞体外增殖的抑制作用明显弱于对原代肿瘤细胞体外增殖的抑制作用，但小檗碱则对两者的抑制作用基本相当；此外，两者联合给药后（各25μM剂量），可提高对原代肿瘤细胞和肿瘤干细胞的抑制作用。证明小檗碱可以显著抑制肿瘤干细胞的体外增殖，且与顺铂联用，可以提高顺铂的化疗效果。

实例3 小檗碱对肿瘤干细胞的诱导凋亡作用

各肿瘤干细胞分别用含10%FBS1640培养基贴壁培养24h后，分别用小檗碱(50μM)、顺铂(50μM)、小檗碱+顺铂(25μM+25μM)联合用药处理24h后，每组收集细胞1x10⁵ cells，用PBS清洗两次，用1x Binding Buffer重悬细胞，加入5µl FITC Annexin V和5µl PI轻轻混匀，25°C处理15min后进行流式分析。每组样品平行检测5次。

图3结果所示，小檗碱可诱导各肿瘤干细胞发生凋亡，其细胞凋亡率均在50%以上，而顺铂诱导各肿瘤干细胞发生凋亡的作用则相对较弱；小檗碱和顺铂联用后，可明显增加肿瘤干细胞的凋亡率，证明小檗碱对化疗药的肿瘤干细胞抑制具有增效作用。

实例4 小檗碱对裸鼠皮下肿瘤组织生长的抑制作用

根据实例1移植瘤结果，分别选取干性基因表达最高的第三代诱导的肿瘤干细胞，轻轻吹打制备成单细胞悬液，500 rcf离心 5 min 收集细胞，经PBS洗涤后，再以PBS重悬细胞，用血球计数板计数后，用无血清培养液稀释细胞至200μl，其所含细胞数为5×10⁴个肿瘤干细胞，用无菌注射器将 200μl 细胞悬液接种于 4 周龄雄性裸鼠腋下或者腹股沟，饲养于标准无菌条件的ICU单元，每隔 3-5 天观察动物生长及成瘤情况。观察成瘤裸鼠瘤块体积约100mm³大小开始给药，实验设置成瘤不给药对照组、小檗碱治疗组(10mg/kg)、顺铂治疗组(10mg/kg)、卡培他滨(1000mg/kg)，每3天给药一次，共给药6次。每次给药后观察记录实验组裸鼠体重和瘤体体积变化。

图4结果所示，小檗碱在10mg/kg的给药剂量下能显著抑制各裸鼠皮下肿瘤的体积，且作用强于顺铂（10mg/kg）。图5结果所示，与模型组相比较，小檗碱治疗组荷瘤裸鼠鼠体重相对略重，而顺铂给药组体重明显减轻，证明小檗碱毒对荷瘤裸鼠的毒副作用相对较小。

实例5 小檗碱对裸鼠皮下肿瘤组织中相关基因表达的影响

分别取各组肿瘤干细胞适量，提取总RNA，进行cDNA合成。根据实例1的PCR条件和引物序列，采用荧光定量PCR技术，测定各组肿瘤组织中相关干性基因Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1 mRNA的表达。尽管如实例4中图4结果所示，给予顺铂治疗后可明显缩小干细胞诱导的肿瘤大小，但结果如图6显示，各顺铂给药组肿瘤组织中Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1 mRNA的表达均显著高于对照组肿瘤组织的表达，证明顺铂可诱导肿瘤干细胞的干性增强，对于后续肿瘤的耐药、转移、复发增加风险性；而给予小檗碱治疗后，肿瘤组织中的Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1mRNA的表达均显著高于对照组和顺铂给药组肿瘤组织的表达，证明小檗碱可逆转肿瘤干细胞干性的表达。

实例6 化疗敏感性实验

将无血清富集的肿瘤干细胞收集于15ml的离心管中，在水平离心机上以1000rpm离心5 min，收集细胞沉淀，利用ACCUTASE细胞消化液置于37°C消化，细胞计数，以每孔3000个细胞的密度均匀种植于96孔板，每板中各种细胞分别5个复孔，每孔100μl的无血清培养基，低粘附96孔板在二氧化碳培养箱培养过夜；种板后第1天，去除培养基，更换为含有不同浓度梯度顺铂（DDP）的培养基培养24h；取出96孔板，MTT每孔20μl，轻轻摇晃后将培养板至于细胞培养箱；4h后将培养板至680型酶标仪检测490nm吸光度值。

对化疗药物耐药也是肿瘤干细胞的特征之一。因此，耐药是肿瘤复发的根源，也是肿瘤治疗的难点。目前文献报道的顺铂体外抑制肿瘤细胞的半数有效抑制浓度（IC₅₀值）在10μg/ml左右，而图7结果所示，在该剂量下，顺铂对各肿瘤干细胞的抑制作用仅20%以下，即高达80%的肿瘤干细胞仍存活，证明各肿瘤干细胞对顺铂的耐药性明显增加，而在同等条件下，给予小檗碱处理，对各肿瘤干细胞的抑制作用明显优于顺铂，证明小檗碱具有更强的抗肿瘤干细胞耐药性的特点。