一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明设及一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，特别是设及一种 包括体外分离人皮肤来源干细胞，体外悬浮培养，将获得的克隆结构进行生殖细胞样细胞 诱导、W及单倍体诱导的方法获得人的单倍体生殖细胞的方法。属于生殖医学的生物医学
技术领域。
【背景技术】：
[0002] 对于干细胞的研究已经有很久的历史，干细胞在生殖领域的研究热点之一就是 利用干细胞分化出生殖配子，W期解决人类的不孕不育问题；另一方面，到目前为止，生殖 配子的发生过程还有许多机制未被发现，建立体外利用干细胞向生殖配子分化的平台，有 助于我们更好的研究生殖配子的发生过程，使我们更好的理解两性配子的结合。2009年， Kee等利用慢病毒载体，向人类的胚胎干细胞巧SCs)转入DAZ家族的Ξ个基因Dazl，Daz， Boule，成功在体外获得了单倍体精子样细胞。而在小鼠方面，化yashi等在2011年利用 小鼠的ESCs和诱导多能干细胞（iPSCs)，体外分化得到原始生殖细胞（PGCs)，之后将分化 得到的PGCs，注射到小鼠曲精细管注射发育，最终获得了成熟的精子，并且可W完成受精 并产生了后代；运些技术的成熟，促进了利用成体干细胞（ASCs)分化生殖细胞的研究。但 是，不管ESCs细胞还是iPSCs细胞，在临床应用上都存在各自的弊端，而人的皮肤来源干 细胞化SDSCs)源于患者自身，在临床应用上不存在组织相容性、致瘤性和伦理等问题。因 此hSDSCs近年来逐渐成为人们研究的热点。2006年，Dyce等利用胎猪的皮肤来源干细胞 (SDSCs)获得了卵母细胞样细胞；2011年，Dyce等通过小鼠的SDSCs,成功获得了具有明显 透明带结构的卵母细胞样细胞（OLCs)。运些研究表明，皮肤来源干细胞具有分化生殖细胞 的潜能。
[0003] 综合最近研究进展，多能性干细胞向生殖细胞的分化具有极大的研究潜力，而且 在ESCsW及iPSCs上已经取得了重要的研究进展，皮肤来源干细胞也同样具有多向分化潜 能，因而也可W作为一种向生殖细胞分化的干细胞来源。
【发明内容】
：
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种人皮肤干细胞体外分化单倍体 生殖细胞的技术方法。本发明方法通过分离人皮肤来源干细胞，体外传代培养，诱导形成生 殖细胞样细胞，然后采用特定的条件培养基培养人的皮肤来源干细胞，一段时间分化后流 式细胞仪检测，可W检测到单倍体样生殖细胞的形成，而且巧光原位杂交（FISH)结果也证 实了类单倍体细胞的形成。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明方法按照如下步骤操作：
[0006] 第一步，人皮肤来源干细胞的体外分离：将人的皮肤组织在显微镜下去除脂肪组 织W及血凝块，转移到培养皿中，用剪刀将皮肤组织剪成小块，之后用含lOOU/ml青霉素 (penicillin)和lOOmg/ml链霉素（str巧tomycin)的DMEM/F12DMEM/F-12(细胞培养液 Du化ecco' s Modified Eagle Medium, F-12 Nutrient Mixture, Gibco公司）培养液清洗3遍，离屯、后弃掉培养液，将剪碎的皮肤组织用膜酶替代物化ypLE Express (Gibco公司）的 消化液中37°C消化，消化结束后，加入DMEM/F12培养液再次清洗3遍，清洗结束后，用枪头 吹打皮肤组织块，使皮肤组织块中的皮肤来源干细胞脱落下来，之后用细胞筛将吹打下来 的单细胞分罔出来.
[0007] 第二步，体外培养人的皮肤来源干细胞：将获得的单细胞悬液用人的皮肤来源干 细胞培养液进行体外传代培养，体外培养的人皮肤来源干细胞在培养2-3天后即可在倒 置显微镜下观察到克隆形态的形成，人的皮肤来源干细胞每隔3-4天需要传代一次，传代 时，将原有的皮肤干细胞克隆W及培养液全部转移至离屯、管中，离屯、，之后弃掉上清，加入 新鲜的培养液，将克隆球吹打至原来体积的1/2-1/3,之后接入一个新的培养皿中继续培 养；所述人皮肤来源干细胞培养液包含DMEM/F12 (Du化ecco's Modified Eagle Medium， F-12 Nutrient Mix1:ure)，20ng/ml表皮生长因子巧GF) ,2% B-27血清替代物（serum supplement)，40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子化FGF)，lOOU/ml青霉素（penicillin)和 lOOmg/ml链霉素（streptomycin)；
[0008] 第Ξ步，人皮肤来源干细胞向生殖细胞样细胞进行诱导：收集传代两次后的人皮 肤来源干细胞克隆，化ypLEExpress消化成单细胞悬液，用生殖细胞诱导培养基重悬单 细胞悬液，将细胞悬液接到悬浮的24孔板中继续培养，每隔两天换液一次；所述生殖细胞 诱导培养基包括TCM199,5μ1/πι1膜岛素转铁蛋白亚砸酸钢ατ巧，3mg/ml牛血清蛋白 度SA)，Img/ml胎球蛋白（feUiin)，0. 23mM丙酬酸钢，Ing/ml表皮生长因子巧GF)，20ng/ml 激活素A(ActivinA)和30ng/ml骨形态发生蛋白4度MP4)，lOOU/ml青霉素和lOOmg/ml链 霉素；
[0009] 第四步，用条件培养基诱导单倍体样生殖细胞形成：将生殖细胞诱导四天的人皮 肤来源干细胞克隆用化ypLEExpress进行消化，将获得的单细胞悬液离屯、，弃掉上清后， 用条件培养基重悬细胞，接到贴壁的24孔板中继续培养，培养过程中两天换液一次，换液 时，轻轻地从边缘吸出150μ1旧培养液，加入200μ1新鲜的条件培养基，在诱导分化的过 程中，DNA倍性分析检测发现在分化的第18天左右，能够检测到1. 79%的单倍体细胞的形 成；所述条件培养基包括DMEM/F12 (Du化ecco'sModifiedEagleMedium,F-12Nutrient MixUire)，15%的胎牛血清（FB巧，1500U/ml白血病抑制因子〇JF)，50mIU促卵泡素（FSH)， lOng/ml表皮生长因子巧GF) ,2%B-27血清替代物（serumsupplement)，5μ1/ml膜岛素 转铁蛋白亚砸酸钢（ITS)，lOOU/ml青霉素和lOOmg/ml链霉素。
[0010] 本发明方法第四步所述人皮肤来源干细胞在单倍体诱导条件培养基诱导分化时， 通过检测分化不同时间SCP3和丫肥AX的表达，能够检测到线状的SCP3染色信号，从而证 明了人皮肤来源干细胞在单倍体诱导条件培养基诱导分化时，能够启动减数分裂；通过巧 光原位杂交检测分化的人皮肤来源干细胞，能够检测到单个巧光信号的类单倍体细胞存 在。
[0011] 本发明方法成功利用体外机械法从人的皮肤组织中分离出人的皮肤来源干细胞， 经过体外培养，生殖细胞诱导，W及条件培养基诱导等分化过程，获得了表达生殖细胞标记 的人单倍体生殖细胞样细胞。本发明方法为更好的研究人类生殖细胞的发生机制提供了一 种很好的体外模型，同时，利用人皮肤来源干细胞向生殖细胞分化，也为不孕不育症患者带 来了新的希望。
【附图说明】：
[0012] 图1为皮肤来源干细胞体外培养形成的克隆图。
[0013] 图2为人皮肤来源干细胞体外诱导形成的生殖细胞样细胞图。
[0014] 图3为流式检测人皮肤来源干细胞诱导形成的单倍体样生殖细胞图。
[0015] 图4为用巧光原位杂交检测形成的单倍体样生殖细胞图。
【具体实施方式】：
[0016] 下面结合附图并通过具体实施例对本发明方法做进一步阐述。
[0017] 实施例1、
[0018] 1、人皮肤来源干细胞的组织定位
[0019] 将人的皮肤组织用4%的多聚甲醒4°C固定过夜，固定好后，将组织块用纱布包 裹，放到广口瓶内并置于自来水龙头下，让自来水缓慢的注入瓶中，进行冲洗，冲洗2-化。 冲洗结束后按照W下步骤进行脱水：50%酒精（15min)-70%酒精（15min)-80%酒精 (20min)-90% 酒精（20min) -95% 酒精I(lOmin)-95% 酒精II(20min) -无水酒精 I(30min)-无水酒精II(30min)-酒精：二甲苯（体积比1 :1，20min)。然后经过两步二甲 苯透明（每步15min)。之后将组织块放入蜡杯，经过两次浸蜡每次1.化后，将组织块包埋 到包埋盒中。包埋好的组织用石蜡切片机将组织切成5μπι的白片。对于肥染色，首先将 切好的白片放到60度热台烤片l-2h，之后按照如下步骤进行染色：二甲苯I(5-10min)-二甲苯II(5-lOmin) -无水酒精I巧min) -无水酒精II(3-5min) -95%酒精1(2-3111；[]1) - 95%酒精11(2-3111111)-80%111111酒精（2111111)-70%酒精（2111111)-50%酒精（2111111)-蒸馈 水（2min)-苏木精（7min)-自来水（2min)-蒸馈水（2min) - 1 %的盐酸酒精（3-5s)-自 来水蓝化巧111111)-蒸馈水（2111111) - 50%酒精（2111111) - 70%酒精（2111111) - 80%111111酒精 (2111111)-伊红（3〇3)-95%酒精1(2-5111111)-95%酒精11(2-5111111)-无水酒精1巧111111)- 无水酒精II(3-5min)-二甲苯I(5min)-二甲苯II巧-lOmin)。染色结束后在样品上滴加 中性树胶并覆盖盖玻片，W长期保存。通过人皮肤的HE染色可W看到在皮下毛囊结构中有 一些结构很致密的细胞存在。对于组化染色，首先将切好的白片放到60度热台烤片化，经 两次二甲苯每步15min将切片上的石蜡脱净。然后按照下表进行复水。
[0020]
[0021] 之后，将复水的切片放入巧樣酸抗原修复液中，96°C下lOmin。之后在室溫下冷却 至室溫。修复液冷却至室溫后，将片子放入预暖的Tris缓冲液（简称TB巧中洗5min，再转 入预暖的0. 1 %Tween-20的化is缓冲液（简称TBST)中洗5min。抗原修复之后的片子，加 上封闭液抓T(30mgBSA和lOOul山羊血清溶于900ulTB巧封闭，大约的用量为50μ1，室 溫封闭30min。封闭结束后，加入Betal-integ;rin(Abcam公司）一抗，放在湿盒中4°C解育 过夜。一抗结束后，加入稀释好的二抗（碧云天公司），用封口膜封住二抗后，放入湿盒内， 用封口袋封住，37度解育30min。解育结束后，用化echs口3342(碧云天公司）染色5min， 然后用VectashielcKVector公司）封片。实验结果显示，体外分离培养的皮肤来源干细胞 主要来源于毛囊结构，而且主要定位于毛囊结构的隆突区。巧光免疫组化结果显示了在毛 囊结构中存在很明显的Betal-integrin阳性的细胞群。
[0022] 2、人皮肤来源干细胞的体外分离
[0023] 将人的皮肤组织在显微镜下去除脂肪组织W及血凝块，转移到6cm的培养皿中， 用剪刀将皮肤组织剪成1mm3左右的小块，之后用含lOOU/ml青霉素和lOOmg/ml链霉素 (Hyclone公司）的DMEM/F12 (G化CO