公司）培养液清洗3遍，离屯、后弃掉培养液，将剪碎的 皮肤组织用2ml的TrypLEExpress(Gibco公司）的消化液中37°C消化15-20min，消化结束 后，加入DMEM/F12再次清洗3遍，清洗结束后，用1ml的枪头吹打皮肤组织块，使皮肤组织 块中的皮肤来源干细胞脱落下来，之后用400目的细胞筛将吹打下来的单细胞分离出来。
[0024] 3、人皮肤来源干细胞的体外培养
[00巧]体外分离的人皮肤来源干细胞，用人皮肤来源干细胞培养液包含DMEM/F12, 2%B-27血清替代物（Gibco公司），20ng/ml表皮生长因子（R&D公司），40ng/ml碱性成纤维细 胞生长因子（Peprotech公司），lOOU/ml青霉素和lOOmg/ml链霉素（Hyclone公司）悬浮 培养，刚刚培养的细胞记为pO代，传代1次后记为pi代，传代时，将原有的皮肤干细胞克隆 W及培养液全部转移至15ml的离屯、管中，150化pm离屯、3min，之后弃掉上清，加入1ml新鲜 的培养液，将克隆球吹打至原来体积的1/2-1/3,之后接入一个新的培养皿中继续培养；图 1为p2代形成的人皮肤来源干细胞克隆结构，其中，左图为p2代2天时形成的克隆结构，右 图为p2代4天时形成的克隆结构，随着培养时间的延长，克隆结构越来越致密，边缘越来越 清晰。
[0026] 3、人皮肤来源干细胞向生殖细胞样细胞进行诱导
[0027] 收集p2代4天的人皮肤来源干细胞，离屯、后弃去上清，加入TrypLEExpress消 化约3min，终止消化后，用培养液清洗一遍人皮肤来源干细胞，W充分去除残余的TrypLE Express,将单细胞悬液1500巧m离屯、5min，用生殖细胞诱导培养基重悬单细胞悬液，将 细胞悬液接到悬浮的24孔板中培养，每隔两天换液一次；生殖细胞诱导培养基包括TCM 1" (Hyclone公司），3mg/ml牛血清蛋白（简称BSA，Solarbio公司），Img/ml胎球蛋白 (fetuin，化化iochem公司），5μ1/ml膜岛素转铁蛋白亚砸酸钢（简称口S，Gibco公司）， 0. 23mM丙酬酸钢（Hyclone公司），Ing/ml表皮生长因子似巧，20ng/ml激活素A(简称 ActivinA，Sigma公司），和30ng/ml骨形态发生蛋白4(简称BMP4，R&D公司），100U/ml青 霉素和lOOmg/ml链霉素（Hyclone公司）。图2为拟胚体诱导的结果，其中，左图为拟胚体 诱导0天时细胞形态结构，右图为拟胚体诱导3天时形成的拟胚体样结构。可W发现人的 皮肤来源干细胞类似人的胚胎干细胞W及诱导多能性干细胞，在拟胚体诱导的过程中可W 形成类拟胚体结构。
[0028] 4、联会复合体巧光染色检测人皮肤来源干细胞进入减数分裂
[0029] 收集人皮肤来源干细胞，用TrypLEExpress消化成单细胞悬液，然后用巧樣酸低 渗液低渗30min，之后将细胞悬液用1%的多聚甲醒固定室溫解育过夜，之后用0.04%的 地otoflo化odak公司）解育4min，然后用1%的山羊血清度oster公司）37°C封闭30min， 封闭结束后，方口入hum曰ηSCP3 (Syn曰ptonem曰 1ComplexProtein3，rabbitpolyclonal， 1:200,NovusBiologicals公司）和丫肥AX(Phospho;rylatedHistone肥AX,mouse polyclonal, 1:200,Abeam公司）的一抗，加入一抗后37°C解育6-化。解育结束后，二抗 goatanti-r油bitIg-CY3/FITC-con化gated(l:100，Sigma公司）二抗 37°C解育化，然后 用Hoechs1:33342(碧云天公司）染色5min，并用VectashielcKVector公司）封片。联会 复合体巧光染色结果显示，分化的人皮肤来源干细胞在诱导分化后可W检测到线状信号的 SCP3和点状信号的丫肥AX染色结果，表明人的皮肤来源干细胞在体外诱导分化时，可W进 入减数分裂。
[0030] 5、人皮肤来源干细胞向单倍体生殖细胞诱导
[0031] 收集拟胚体样结构，加入化ypLEExpress消化3min左右，用移液器将克隆结构吹 打成为单细胞悬液，终止消化后再加入新鲜培养液重悬细胞，150化pm离屯、5min，弃上清， W充分弃掉消化液，将收集的单细胞悬液用条件培养基重悬，接到贴壁的24孔板中继续培 养，每隔两天换液一次，换液时，吸出150μ1旧培养液，加入200μ1新的培养液；培养过程 中收集细胞进行DNA倍性分析，在分化的第18天能够检测到约有1. 79 %比例的单倍体样 生殖细胞的形成。所述条件培养基包括DMEM/F12 (Du化ecco'sModifiedEagleMedium， F-12NutrientMixUire)，15% 的胎牛血清（FBS)，1500U/ml白血病抑制因子 〇JF)，50mIU 促卵泡素（FSH)，lOng/ml表皮生长因子巧GF)，2%B-27血清替代物（serumsupplement)， 5μ1/ml膜岛素转铁蛋白亚砸酸钢（ITS)，lOOU/ml青霉素和lOOmg/ml链霉素。图3为流式 检测人皮肤来源干细胞形成的单倍体样生殖细胞的结果。结果显示，人皮肤来源干细胞在 体外诱导分化后，可W形成类单倍体细胞，而且在分化的第25天，单倍体形成效率最高。
[0032] 6、巧光原位杂交检测人皮肤来源干细胞分化得到的单倍体样生殖细胞
[0033] 收集分化后的人皮肤来源干细胞单细胞悬液，用50μ1的PBS重悬后，滴到 APES(中山金桥公司）处理的在载玻片上，置于热台烘干，然后用Carnoy固定液室溫固定 5min。固定结束后用2xSSC室溫解育lOmin，再用1%的多聚甲醒（Solarbio公司）室溫固 定lOmin，将片子转移到0. 1%NP-40(生工公司）的SSCbuffer中室溫解育lOmin。然后 将片子按照80%酒精（2min)-90%酒精（2min)-100酒精（2min)进行脱水。等片子风干 后，加入杂交buffer,具体配制如下：
[0034]
[0035] 加入杂交buffer后，将片子用r址)bercement巧Imer's公司）封好，然后放在湿盒 内37°C解育4她，解育结束后，去掉riAbercement,将片子放在2xSSC中45°C解育30min。 解育结束后，用化echs口3342染核5min，并用Vectashield封片。图4为人皮肤来源干细 胞分化后得到的单倍体样生殖细胞的巧光原位杂交结果，相对于正常的二倍体体细胞，形 成的单倍体样生殖细胞具有单个巧光信号。
[0036] 本发明方法获得了与人体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的 原始生殖细胞，而且在合适的条件培养基的分化过程中，可W获得人类的单倍体生殖细胞。
【主权项】
1. 一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，其特征在于按照如下步骤 操作：第一步，人皮肤来源干细胞的体外分离：将人的皮肤组织在显微镜下去除脂肪组织 以及血凝块，转移到培养皿中，用剪刀将皮肤组织剪成小块，之后用含?οου/ml青霉素和 100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养液清洗3遍，离心后弃掉培养液，将剪碎的皮肤组织用胰 酶替代物TrypLE Express的消化液中37°C消化，消化结束后，加入DMEM/F12培养液再次 清洗3遍，清洗结束后，用枪头吹打皮肤组织块，使皮肤组织块中的皮肤来源干细胞脱落下 来，之后用细胞筛将吹打下来的单细胞分离出来；第二步，体外培养人的皮肤来源干细胞： 将获得的单细胞悬液用人的皮肤来源干细胞培养液进行体外传代培养，体外培养的人皮肤 来源干细胞在培养2-3天后即可在倒置显微镜下观察到克隆形态的形成，人的皮肤来源干 细胞每隔3-4天传代一次，传代时，将原有的皮肤干细胞克隆以及培养液全部转移至离心 管中，离心，之后弃掉上清，加入新鲜的培养液，将克隆球吹打至原来体积的1/2-1/3,之后 接入一个新的培养皿中继续培养；所述人皮肤来源干细胞培养液包含DMEM/F12,20ng/ml 表皮生长因子，2% B-27血清替代物，40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，100U/ml青霉素 和100mg/ml链霉素；第三步，人皮肤来源干细胞向生殖细胞样细胞进行诱导：收集传代两 次后的人皮肤来源干细胞克隆，TrypLE Express消化成单细胞悬液，用生殖细胞诱导培养 基重悬单细胞悬液，将细胞悬液接到悬浮的24孔板中继续培养，每隔两天换液一次；所述 生殖细胞诱导培养基包括TCM 199,5 μ Ι/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠，3mg/ml牛血清蛋 白，lmg/ml胎球蛋白，0· 23mM丙酮酸钠，lng/ml表皮生长因子，20ng/ml激活素A和30ng/ ml骨形态发生蛋白4,100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素；第四步，用条件培养基诱导单倍 体样生殖细胞形成：将生殖细胞诱导四天的人皮肤来源干细胞克隆用TrypLE Express进 行消化，将获得的单细胞悬液离心，弃掉上清后，用条件培养基重悬细胞，接到贴壁的24孔 板中继续培养，培养过程中两天换液一次，换液时，轻轻地从边缘吸出150 μ 1旧培养液，加 入200 μ 1新鲜的条件培养基，在诱导分化的过程中，DNA倍性分析检测发现在分化的第18 天，能够检测到1. 79%的单倍体细胞的形成；所述条件培养基包括DMEM/F12,15%的胎牛 血清，1500U/ml白血病抑制因子，50mIU促卵泡素，10ng/ml表皮生长因子，2% Β-27血清替 代物，5 μ Ι/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。2. 根据权利要求1所述的一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，其特征 在于第四步所述人皮肤来源干细胞在单倍体诱导条件培养基诱导分化时，通过检测分化不 同时间SCP3和γ H2AX的表达，能够检测到线状的SCP3染色信号，人皮肤来源干细胞在单 倍体诱导条件培养基诱导分化时，能够启动减数分裂；通过荧光原位杂交检测分化的人皮 肤来源干细胞，能够检测到单个荧光信号的类单倍体细胞存在。
【专利摘要】本发明涉及一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，操作步骤如下：体外分离后再体外培养人皮肤来源干细胞，分离的人皮肤来源干细胞在体外悬浮培养时会形成球状的克隆样结构，每隔四天传代一次，传代后获得人皮肤来源干细胞克隆球；将人的皮肤来源干细胞向生殖细胞样细胞诱导；人的皮肤来源干细胞向单倍体生殖细胞诱导分化，在分化约18天以后，DNA倍性分析可以检测到1.79％的单倍体样细胞形成。本发明方法获得了与人体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的原始生殖细胞，且在合适的条件培养基的分化过程中，获得了人类的单倍体生殖细胞，为研究人类生殖细胞的发生机制提供了一种很好的体外模型。<!-- 2 -->
【IPC分类】C12N5/075, C12N5/076
【公开号】CN105368773
【申请号】CN201510975331
【发明人】葛伟, 孙源超, 沈伟
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月23日