一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于微生物技术领域，特别设及一株能高效生产戊二胺的基因工程菌及其 应用。
【背景技术】：
[0002] 1，5-戊二胺，又名尸胺（cadaverine)、1，5-二氨基戊烧、五亚甲基二胺或尸毒素， 是脂肪族生物胺类（包括精胺、腐胺、亚精胺和戊二胺等）中的一种。1885年，德国柏林的 医师LudwigBrieger在腐败的尸体中首次发现该胺类，并W此得名尸胺。在细胞内，戊二 胺是赖氨酸合成途径的延伸反应，是赖氨酸在赖氨酸脱簇酶巧.C. 4. 1. 1. 18)的作用下脱 簇产生的（如附图1)，作为一种肉毒胺存在于腐败物中，与鸟氨酸的脱簇产物腐胺一样都 是生物尸体腐败产生的气味中的一种成分。运种二胺不仅与腐败作用有关，生物活体在生 命代谢中也会产生少量的戊二胺，是生物体内广泛存在的具有生物活性的含氮碱。
[0003] 戊二胺具有许多重要的生理功能，如戊二胺是微生物细胞内调节铁离子浓度的 "铁亲和系统"和一些严格厌氧的革兰氏阴性菌肤聚糖的主要组成成分；戊二胺在关闭微孔 蛋白通道和保护大肠杆菌免受氧的毒害方面也起着重要的作用；内源性戊二胺的分泌W及 胞内高浓度戊二胺积累可导致外膜渗透性降低，抑制某些抗生素如头抱霉素类抗生素的作 用。
[0004] 戊二胺在农业、医学和工业上均具有广泛的应用。在农业上，外源施加戊二胺可W 改善坐果和促进果实发育，提高果实的产量；在医学上，它也可作为一种有效治疗频疾的药 物；在工业上，戊二胺与二元酸进行聚合反应可合成优质高分子材料。 阳〇化]微生物法生产戊二胺，是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径，而现有技术更 多的关注在赖氨酸脱簇酶的表达和重组菌的构建等。
[0006] 如：由日本的东丽株式会社申请的专利号为公开号为CN102844440A的中国专 利《1，5-戊二胺的制造方法》公开了一种利用微生物发酵的1，5-戊二胺的制造方法，所 使用的微生物是染色体中具有LDC基因的棒状杆菌，可使棒状杆菌在培养过程中持续保持 20mU/mg蛋白W上的赖氨酸脱簇酶活性。 阳007] 德国的己斯夫欧洲公司申请的公开号为CN101389765A的专利《生产尸胺的方 法》公开了一种通过构建重组微生物并培养所述微生物来生产尸胺的方法 [000引德国的赢创德固赛有限责任公司申请的公开号为CN101240258A的专利则公布 了戊二胺制备相关专利关注的是发酵条件优化和重组菌构建过程的保护。
[0009] 可见，现有技术并没有在如何更高效的制备用于戊二胺合成的催化细胞方面进行 技术创新性研究。本发明则通过建立戊二胺合成所需催化细胞及其高效制备方法，从而实 现戊二胺的大规模制备过程。
【发明内容】
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[0010] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种可高效生产戊二胺的基因工程菌W及利 用其制备戊二胺的高效制备工艺。
[0011] 本发明所提供的技术方案之一是，提供一种可高效生产戊二胺的基因工程菌，所 述基因工程菌其赖氨酸脱簇酶启动子IdcCp被替换为环境/营养因素控制型启动子，使得 生产菌株在生长过程中不大量合成目标酶，即目标酶的痕量合成不影响细胞生长，而在生 长完成后通过改变环境/营养因素快速过量表达目标酶及其辅因子。
[0012] 进一步的，所述基因工程菌其出发菌株，可W为大肠杆菌K12、D册α、W3110、BL21、 MG1655 等；
[0013] 更进一步的，所述出发菌株为大肠杆菌B0013-070;
[0014] 进一步的，所述环境/营养因素控制型启动子可W是抑、溫度、溶氧等控制型启动 子，也可W是多种营养因素如乳糖、木糖、阿拉伯糖等控制型启动子；
[0015] 更进一步的，所述控制型启动子为溫度调控性启动子动子；
[0016] 所述Pk-Pl启动子的核巧酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示；
[0017] 进一步的，所述基因工程菌在替换启动子的同时表达信号肤，使得重组菌株可W 在细胞周质空间大量表达赖氨酸脱簇酶；
[0018] 所述信号肤由基因pelBs编码，核巧酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示；
[0019] 进一步的，本发明所提供的基因工程菌为大肠埃希氏菌巧scherichiacoli)42#, 所述菌株已于2014年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏编号CGMCCNo. 10240。
[0020] 更进一步地，本发明菌种在较低的溫度下，如25~36°C，目标酶编码基因IdcC的 转录被强烈抑制；而在较高溫度下，如37~50°C，目标酶编码基因IdcC的转录被强烈启 动。
[0021] 本发明所提供的技术方案之二：是一种制备戊二胺的高效工艺，所述制备工艺是 利用技术方案一所述的基因工程菌为生产菌株发酵生产戊二胺，在发酵初期的6~12h内， 培养溫度控制在25~36°C，进行菌体的快速生长；在余下的发酵阶段溫度控制在37~ 50°C，诱导产酶1~化，转化2~化，产戊二胺水平达到10.6~11.6% (w/v)或W上；其工 艺特征是：25~5(TC的条件下，分别经过发酵培养菌体，变溫高效产酶和目标产物快速转 化Ξ个阶段，产戊二胺水平达到106-116. 8g/l，赖氨酸转化率达到了理论转化率的91 %~ 97% ；
[0022] 进一步的，发酵过程中使用的培养基为全合成培养基；
[0023] 更进一步地，本发明建立的关键酶高效制备工艺和快速转化工艺不限于戊二胺的 制备，还包括具有类似反应过程的其他化学品，如丙酬酸、丙氨酸、乳酸、α-酬戊二酸、下二 酸、衣康酸W及多种功能糖等等。
[0024] 有益效果：
[0025] 1、本发明提供的基因工程菌具有明显的高效转化赖氨酸合成戊二胺的能力，菌 种在25~50°C的条件下培养6~12h，诱导产酶1~化，转化2~化，从培养细胞到戊 二胺转化完成工耗时9-25h，产戊二胺水平达到10.6~11.6% (w/v)或W上，产量达到 106-116.8g/L;
[00%] 2、本发明中使用的表达宿主菌其表达酶的过程在细胞膜完成，最终表达的酶介于 细胞内膜与细胞壁之间，而不释放的发酵体系中，进而可W实现催化细胞的重复使用。
[0027] 3、由于本发明所制备的基因工程就其出发菌株为大肠杆菌，因此表达催化剂的细 胞同时可W完成辅因子的合成，在用于赖氨酸转化为戊二胺的过程中可W使用完整的细胞 直接进行底物到产物的转化，细胞同时起到了提供催化剂作用的场所和保护催化剂活性的 作用，其中辅因子的存在为催化剂的高活性提供了保证。
[0028] 4、本发明的戊二胺生物转化基因工程菌，在菌体培养过程中，采用全合成培养基， 培养液澄清，有利于后续产品分离提取；本发明转化过程使用的原料可W是未经后提取处 理的赖氨酸发酵料液；本发明转化过程的效率不受赖氨酸发酵料液残余物的影响；本发 明设及的转化过程完成后形成的戊二胺盐易于后提取和纯化。5、本发明的戊二胺生物转化 基因工程菌，在菌体培养、诱导产酶和高效转化过程中，戊二胺积累达较高水平，为后续提 取纯化提供了便捷。
[0029] 6、本发明的戊二胺高效转化过程：用于催化的菌体细胞生长溫度在25~36°C下 利用葡萄糖快速生长6~12h，形成菌体；快速诱导产酶1~化后，在37~50°C下快速转 化赖氨酸合成戊二胺。即：运用本发明的重组菌及其戊二胺制备工艺，戊二胺的生产过程仅 需改变发酵溫度控制参数，即可实现W赖氨酸为原料高效生成戊二胺。
【附图说明】
[0030] 图1赖氨酸脱簇反应；
[0031] 图2重组质粒pT-ldcC的物理图谱；
[0032]图3赖氨酸脱簇酶启动子功能鉴定结果；
[0033] 图4赖氨酸脱簇酶信号肤功能鉴定结果；
[0034] 图5戊二胺局效制备流程图；
[0035] 图6戊二胺HPLC检测图谱；
[0036] 图7小试水平戊二胺转化进程；
[0037] 图8规模化生产下戊二胺转化进程。
【具体实施方式】：
[0038] 实施例1:大肠杆菌染色体赖氨酸脱簇酶溫度调控型启动子和信号肤的替换
[0039]1，IdcC基因部分序列的克隆 W40]W大肠杆菌B0013-070染色体DNA为模板，用引物ldc-upl(SEQIDN0:：3)和ldc-up2(SEQIDN0:4)进行PCR扩增IdcC5'端及其上游序列（IdcC-up)，两端通过引物 加入EcoRI位点。PCR产物大小~92化P;将PCR产物克隆入pMD-18T-simple，获得重组质 粒pU)C-UP;
[0041] Idc-upl：GGAATTCGCAACCTGCGTGAAATGTC；EcoRI
[0042] ldc-up2：GGAATTCTGAACGGCGGTGTAATGTT；EcoRI
[0043] 2,IdcC基因重组同源臂的获得
[0044]EcoRI酶切重组质粒pLDC-UP释放915bp和2. 7化片段；W重组质粒pLDC-up的 DNA为模板，用引物ldc-invF(SEQIDN0:5)和ldc-invR(SEQIDN0:6)进行反向PCR扩 增，PCR产物为IdcC基因上游部分序列含启动子部分，即LDC-up大小~3. 57化。
[0045] Idc-invF：GTTCGGATCCGAACATCATTGCCATTATGGGAC；BamHI
[0046] Idc-invR：GGGCTCAAACCGTGGCGATAAA
[0047] 3,溫控型启动子和分泌型信号肤的获得
[0048] PCR扩增PPL451 (Gene, 1996, 176:49 ~53)的pL启动子（引物pkF(SEQID N0:7)和pkR(SEQIDN0:8))，PCR产物大小~1.37化。PCR产物用BamHI和Spel度cul) 酶切、pET-2化用Bglll和甜al、连接转化溫控型启动子片段pL和信号肤序列pelBs获得 质粒pPkpelBs,大小5. 0化；SmaI和BamHI双酶切pPkpelBs，胶分离pkpelBs片段，大 小1. 48化。
[0049] pL-F：ATCAGGATCCCGGGTGATGATTATCAGCCAGCAGAGATT；Ba