一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蓝藻基因工程领域。具体设及一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季 风性湿润气候区生长的水稻中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（sativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一，70年代培育成功的=系杂交 水稻是我国水稻育种事业的重大突破。但是，=系法杂交水稻是建立在质核互作型雄性不 育系基础之上的，在S系法（不育系、保持系、恢复系）杂交水稻的应用过程中，种子生产要 经过两个步骤；恢复系在现有品种中存在的比例也很低；=系不育系的细胞质对杂种的产 量性状存在有不同程度的负效应，影响了杂种优势的充分发挥。两系法杂交水稻是建立在 光溫敏核不育系的基础之上的，运类不育系的花粉育性随发育期间所经历的不同光照长度 或不同的高低溫度而表现出不育或可育，在不育的时期用做母本进行制种，在可育的时期 用来自身繁殖，不需要保持系。所W称为两系法杂交水稻。两系法杂交水稻比=系法杂交 水稻具有更加深远的意义（尹华奇，1997年）。
[0003] 广占63s是用M22S与矮广占63杂交后自交选育成的光溫敏感型核不育系，已 经组配了较多组合，有些组合因不育系纯度不够，在生产实践中存在诸如不育系繁殖去杂、 制种母本去杂、杂交种纯度鉴定难等问题，如能用隐性标记性状标记纯度，可解决上述问题 (陈庭木，2010年）。广占63黄华苗（或称广占63黄叶突变体）是广占63S-隐性基因 发生突变得到的突变体，该突变体叶片黄色，可作为筛选标记。但是由于该基因的突变，导 致该突变体在长江流域（W武汉为例）生长缓慢，不分葉不结巧，因而失去了其不育系的作 用。目前广占63黄叶突变体仅在海南可生长，分葉并结巧，实现其不育系的作用。
[0004] 本发明将聚球藻7002的基因SYNPCC7002_A1180通过分子手段转入到广占63黄 叶突变体中，得到新的转1180基因突变株。新的转1180基因突变株能部分回补广占63 黄叶突变体的生长性状，使其在长江流域能够生长，能分葉并且结巧，并且带有黄色选择标 记，恢复其不育系的作用。
【发明内容】
阳0化]本发明的目的在于提供一种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区 生长的水稻中的应用，所述的聚球藻基因为SEQIDNO. 1所示，编码的蛋白质为SEQID NO. 2所示。将该基因通过转基因手段转入广占63黄华苗（本发明或称广占63黄叶突变 体）中，得到的转基因水稻在武汉地区生长分葉且结巧。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用W下技术措施：
[0007] -种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用，将 SEQIDNO. 1所示的基因通过分子生物学的方式转入广占63黄华苗中，获得的转基因植株 可在武汉地区生长分葉且结巧。
[0008] 更详细的方案请详见【具体实施方式】。
[0009] 与现有技术相比，本发明具有W下优点：
[0010] 本发明将聚球藻7002的基因SYNPCC7002_A1180通过分子手段转入到广占63黄 叶突变体中，得到新的转1180基因突变株。新的转1180基因突变株能部分回补广占63 黄叶突变体的生长性状，使其在长江流域能够生长，能分葉并且结巧，并且带有黄色选择标 记，恢复其不育系的作用。黄叶不育系在繁殖与制种过程中可W将全部青叶株去除，在杂交 种应用时将黄叶株去除或移栽时剔除。依靠黄叶不育系自身携带的黄色选择标记，可在生 产实践中解决不育系繁殖去杂、制种母本去杂、杂交种纯度鉴定难等问题。
【附图说明】
[0011] 图1为基因5￥邮0：7002_41180转化广占63黄叶突变体值32)口0?检测结果图。 阳01引图2为目的基因SYNPCC7002_A1180转化的广占63黄华苗生长情况图。
[0013] 图3为广占63黄叶突变体生长情况图。
[0014] 图4为目的基因SYNPCC7002_A1180转化的广占63黄华苗Fl代生长情况图。
【具体实施方式】
[0015] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或原料， 如未特别说明，均来自于商业渠道。
[0016] 实施例1:
[0017] -种聚球藻基因在制备适用于亚热带季风性湿润气候区生长的水稻中的应用，应 用过程包括：
[0018] 1) W提取的野生型聚球藻PCC7002 (Synechococcus sp. PCC7002)(编号 NC_010475. 1)基因组为模板，引物1180F/1180R扩增基因SYNPCC7002_A1180编号 gi|l69885466。？CR条件为94°C 4min预变性，94°C 30s，55°C 30s，72°C Imin,共35个循 环，最后72°C延伸lOmin。
[0019] 1180F :ATGTCCCACTTTAGCACTCTC，1180R :TTACTTTTGCAATACCAGTTT
[0020] 2)PCR产物电泳后切胶，用DNA凝胶回收试剂盒回收（AXYGEN公司）。连接体系包 括PCR回收产物4ul，T载体（pEASY-Tl，全式金生物技术有限公司）0. 8ul，轻轻混合，25°C 恒溫培养15min。于超净台中将连接体系加入到50ul大肠菌感受态细胞（Transl-Tl，全 式金生物技术有限公司）之中，冰浴30min，42°C热击90s。冰浴2min后加入SOOuILB培 养基，37°C，180r/min恢复1小时。将菌液6000r/min离屯、Imin,吸弃上清液400ul，向剩 余的IOOul加入50ulX-gal(25mg/ml)和加1IPTG(ImoVL),将菌液均匀的涂在氨节抗性 (八1邱+化8平板上，37°(：溫箱倒置过夜。得到阳性重组质粒1180-1'1。
[0021] 3)用限制性内切酶BamHl和甜曰1双酶切重组质粒1180-T1和水稻表达载体 pBWA(V)HS(武汉伯远生物技术有限公司提供），电泳检测酶切结果，切胶回收酶切产物。经 纯化的基因片段SYNPCC7002_A0987和纯化的pBWA(V)服载体片段按摩尔比1:3混合，在连 接酶作用下，16°C水浴过夜酶连。构建转基因载体pBWA(V)服-A1180。
[0022] 3)将转基因载体导入根瘤农杆菌中。取农杆菌感受态细胞，冰上融化W后，加入 Iug构建好的质粒地WA (V)服-Al 180DNA，混匀，依次置于冰浴、液N2和37°C水浴中各5mi n， 加入800微升新鲜的YM培养基，于28°C10化pm振荡培养2-4小时。取200uL涂布于含潮 霉素的YM培养基上，28°C培养2-3天。重组质粒酶切鉴定。