Agpat9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因在抗肿瘤药物制备和诊断试剂盒生产的应用领域，具体涉及 AGPAT9基因在制备治疗肿瘤特别是肝癌的药物和生产肿瘤诊断试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 原发性肝细胞肝癌（简称肝癌）是一种常见肿瘤，其发病率在全世界范围内排第 五，每年大概有100万人新发肝癌;肝癌的死亡率在肿瘤致死率中位列第三，每年因为肝癌 而死亡的人口在70万左右。肝癌的分布具有明显的地区差异，我国属于高发地区，每年肝癌 的死亡病例约为30万。研究显示，近二十年来肝癌的发病率在我国呈上升趋势，其在九大恶 性肿瘤死亡率的排名中已从第三位上升到第二位。由于肝癌发病隐匿，病人首诊往往已属 中晚期且伴有肝硬化，手术切除率仅为5%~10%。尽管肝癌的临床研究在近十多年中已取 得长足的进展，但肝癌五年生存率仍非常低而且复发率高，术后5年复发率仍高达60%以 上。肝细胞癌的高发病率、高死亡率及其逐年增高的趋势，已成为一个极其严重的国际卫生 问题。由此可见，单靠临床研究来提高肝癌病人的生存率和降低复发率是不够的。
[0003] 近年来随着分子生物学技术的发展，分子靶向治疗成为肝癌治疗的新方向。分子 靶向治疗药物通过特异性阻断干预关键基因和重要的信号传导通路发挥抑癌作用，具有特 异性强，疗效显著，不良反应小等优点，为肝癌临床诊断、治疗和预后提供了崭新的方法和 手段。因此，采用先进的分子生物学技术，通过深入了解肝癌发生发展的分子机制，筛选、鉴 定出重要的靶分子，为开发肝癌靶向治疗药物，以及肝癌的基因早期诊断、基因个性化治疗 和预后评估提供理论基础，从而可望提高肝癌病人的生存率。
[0004] AGPAT9基因，全名叫 1-acylglycerol-3-phosphate-〇_acyltransferase 9，在美 国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information)基因库的 登录号为NM_032717.4,位于人类染色体4q21.23,是溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)家族成 员之一。AGPAT9基因于2003年从肺癌转移相关基因中分离鉴定，之后的研究证实其与肺癌 组织的恶性表型密切相关。AGPAT9基因的表达和功能研究在其它肿瘤中尚未见报道。
[0005] 肝癌和肺癌的发病机制及肿瘤相关基因变化有较大差异。一般而言，用于肺部肿 瘤的研究结论在肝癌中并不适用。现阶段，未有研究表明AGPAT9基因与肝癌相关。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供AGPAT9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中 的应用。
[0007] 发明人在肿瘤研究中发现，AGPAT9基因在肝癌中发生了高频率的遗传变异一一 DNA扩增，基因转录的mRNA和蛋白明显升高，结合临床资料分析发现，其表达高低与病人预 后密切相关。
[0008] 发明人对AGPAT9基因进行了体外细胞功能学的研究，将靶向抑制AGPAT9基因的 siRNA转染到Hep-3B细胞中瞬时敲降AGPAT9蛋白的表达之后，其生长速度、克隆形成能力及 细胞侵袭能力等均显著下降，并且该基因能使细胞阻滞于G0/G1期。构建AGPAT9 shRNA载体 并转染具有高致瘤性和转移能力的MHCC-97H肝癌细胞系中，建立稳定敲降AGPAT9的细胞 系。动物实验研究结果发现，敲降AGPAT9可显著降低裸鼠皮下移殖瘤形成的数目和大小;细 胞经尾静脉注射入裸鼠体内后，结果发现敲降AGPAT9可显著降低肺转移灶形成。因此，发明 人的体内外实验结果证实AGPAT9在肝癌中起着促癌促转移的作用。因此，可以合成或制作 此基因的抑制物，作为肝癌潜在的靶向治疗药物；由于该基因在肝癌中有DNA扩增和mRNA及 蛋白表达升高，故可制作检测该基因 DNA变异和表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌；由于该 基因表达的降低与病人预后密切相关，故检测其表达水平变化的试剂盒也可用于其预后的 评估，以指导临床的治疗。
[0009] 通过检测肝癌病人中AGPAT9基因的DNA扩增和表达情况，发现AGPAT9基因发生了 高频率的DNA扩增，而且其mRNA和蛋白的表达也明显升高，因此，二者均可作为肝癌的诊断 标志；该基因 mRNA和蛋白的表达水平与肝癌的预后明显相关，即可作为诊断之用也可作为 其预后的评价指标。同时，对AGPAT9基因进行细胞功能学的研究，发现干扰AGPAT9基因表达 后，肝癌细胞生长速度减慢、细胞周期阻滞、克隆形成能力和细胞侵袭能力等均显著下降； 动物实验证实裸鼠移殖瘤的形成和肺转移灶均显著减少。因此，该基因的细胞生物学功能 研究为制备基因药物和靶向药物提供了依据。本发明不仅在基因遗传、转录(mRNA)和翻译 (蛋白）三个水平上也在细胞生物学功能方面为制备治疗肿瘤的新药物和诊断及预后评估 试剂盒的开发提供了基础。
【附图说明】
[0010] 图1是27例肝癌组织AGPAT9基因的拷贝数变化情况； 图2是51对肝癌组织和癌旁组织AGPAT9基因 mRNA水平的表达情况； 图3是AGPAT9蛋白表达与226例肝癌患者预后的关系； 图4是Western blot验证在肝癌细胞系中的AGPAT9敲降效果； 图5是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞增殖速度变慢； 图6是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的G1期细胞比例增加，G2/M期细胞 比例减少显著下调，提示细胞周期阻滞； 图7是肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的克隆形成能力降低； 图8是肝癌细胞中AGPAT9表达受s i RNA抑制后，细胞的侵袭能力降低； 图9是肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞注射于裸鼠皮下，形成的移殖瘤 数目和大小显著减少； 图10是肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞经尾静脉注射后，在裸鼠体内 的转移能力降低。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实验数据，进一步说明本发明的技术方案。
[0012 ] 实时荧光定量PCR (qPCR)检测AGPAT9基因 DNA拷贝数 提取肝癌及癌旁组织DNA，实时定量PCR方法扩增AGPAT9基因片段，采用的引物序列见 表1:本实验所需的探针，引物由广州英俊公司合成。qPCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。 [0013]表1:检测AGPAT9DNA拷贝数变化所使用的引物
引物采用引物设计软件Primer Premier5.0设计，引物设计确保跨内含子，以避免残留 mRNA的干扰。在NCBI网站上对所有引物序列进行BLAST比对，确定引物序列不与人类其他基 因同源。
[0014]定量PCR扩增体系的组成如表2所示。
[0015]表2:定量PCR扩增体系成份
扩增反应包括：95 °C变性30秒，60 °C退火及延伸1分钟，共45个循环反应。应用ABI PRISM7900Sequence Detector序列检测系统对反应产物进行实时定量测定和融解曲线分 析，分别设2个复孔。内参用Line-Ι，以标准曲线法算出内参及目的基因的相对表达值(倍比 稀释正常人血gDNA，定量PCR扩增后，以CT值来计算标准曲线），以内参作为基准进行校正， 得出目的基因与内参的比值L2份正常人粒细胞提取genomic DNA作为正常对照标本。以正 常对照标本中目的基因与内参的比值R的平均数作为基准，进行标准化。以正常对照标本中 拷贝数的1.5倍作为正常拷贝数的变动范围。如大于正常对照标本中拷贝数的1.5倍，则该 标本拷贝数扩增;如小于正常对照标本中拷贝数的1.5倍，则该标本拷贝数丢失（图1)。图1 中，Y轴表示肿瘤组织DNA拷贝数与正常人genomic DNA拷贝数的比值，以2的指数来表示Y轴 上的刻度，蓝色线表示比值大于2的0.585次方，换算后即为3倍，X轴表示实际编号，本实验 设3个平行复孔。
[0016] qRT-PCR检测AGPAT9基因 mRNA水平表达 提取组织总RNA，采用Promega公司的逆转录反应试剂盒，Oligo(dT)作为随机引物进行 逆转录反应，qPCR扩增体系如表3所示。
[0017] 表3:AGPAT9qPCR扩增体系成份
所用引物，均为跨内含子引物，采用引物设计软件Primer Premier5 · 0设计。在NCBI网 站上对所有引物序列进行BLAST比对，确定引物序列不与人类其他基因同源。具体的定量 PCR引物序列如表4所示。
[0018] 表4:定量PCR引物序列
[0019] AGPAT9特异性扩增反应包括:95°C变性30秒，60°C退火及延伸1分钟，共45个循环 反应。应用ABI PRISM 7900Sequence Detector序列检测系统对反应产物进行实时定量测 定和融解曲线分析，分别进行三次平行实验。内参用GAPDH，以threshold cycle(CT)法进行 表达水平的比较，用以下公式计算:2_ΛΛα( Δ Δ CT =肿瘤Δ CT-癌旁Δ CT)，每个Δ CT= Δ CT (AGPAT9)- Δ CT(GAPDH)。以10对癌旁肝组织的倍数变化平均值为1.0,进行标准化(图2)。
[0020]肝癌组织中AGPAT9蛋白表达及其对病人的预后评价 实验操作如下： 1) 石蜡切片常规脱蜡、水化： 2) 抗原修复:玻片放入枸橼酸钠（lmM，pH 6.0)的抗原修复液盒子里，微波加热至溶液 沸腾，25分钟；自然冷却后，PBS 15min X 3次； 3) 阻断肝组织内源性过氧化物酶的活性:滴加3%过氧化氢去离子水，室温避光孵育30 分钟，以PBS浸泡15分钟洗片X 3次； 4) 一抗孵育：滴加 100μΙ AGAPT9抗体工作液(Sigma，1:100)，置于湿盒中，4°C孵育过 夜;PBS清洗15分钟洗片X 3次； 5) 二抗孵育:滴加 100μΙ特异性二抗工作液于组织上，湿盒内室温孵育60分钟;PBS清洗 15分钟洗片X 3次； 6) 曝光:滴加显色剂DAB工作液100μΙ，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色； 7) 苏木素复染10分钟，1 %盐酸酒精浸泡10秒