进行分化，水洗30分钟返蓝； 8) 多级酒精(70 %~100 % )脱水，每级15分钟;置二甲苯中透明，10分钟X 1次;镜下观 察结果； 9) 结果判定和阈值设定:凡细胞中出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞;评分方法如下： 细胞染色强度评分:〇_(无染色），1 + (弱染色），2+(中染色），3+(强染色）肿瘤细胞阳性率评 分:0(0~9% )，1(10%~25% )，2(26%~50% )，3(51%~100%);将染色强度评分和阳性 细胞率评分的乘积作为该切片评分值;设定评分< 3为低表达，>3为高表达； 10)采用SPSS 17.0统计学软件包及Graph-pad prism 5.0软件处理和分析实验数据和 制图，AGPAT9免疫组化评分和预后指标间关系采用X2检验及Pearson等级相关进行分析，用 Kaplan-Meier生存曲线和Cox比例风险回归模型进行生存分析。以P〈0.05为差异具有统计 学意义。以P〈〇. 05确定为差异具有显著性，双侧检验(图3)。
[0021]从图3可以看出，肝癌组织中的AGPAT9蛋白表达量对患者的总生存期（图3A)和无 疾病生存期（图3B)有显著影响。
[0022] AGPAT9基因敲降细胞的建立 Lipofectamine RNAi MAX试剂化学法瞬时干扰Hep-3B细胞株AGPAT9表达： 加入AGPAT9干扰序列及空白随机序列(表5)与Lipofectamine RNAi MAX混合后加入细 胞中，37°C培养6小时。弃去上述培养液，加含血清的培养基继续培养48小时。Western Blot 验证AGPAT9蛋白的敲降效率(图4)。
[0023] 表5:所使用的AGPAT siRNA序列
[0024] AGPAT9稳定敲降肝癌细胞株的建立： 将AGPAT9 siRNA-264序列克隆到pSUPER· Retro · Puro载体(01 igoEngine，USA)上，构建 针对人AGPAT9基因逆转录病毒介导的RNA干扰表达载体pSUPER.Retro.Puro-shRNA并包装 成逆转录病毒，在?〇15^代116(811^/1111，31〖1]^)介导下感染腿(]〇97细胞，表达空载体的病毒 液作为对照。
[0025] 从图4可以看出，肝癌细胞系Hep-3B和MHCC-97H分别瞬时转染AGPAT9 siRNA和稳 定转染shAGPAT9后，AGPAT9蛋白的表达均显著下调。
[0026] 细胞增殖检测： 将敲降AGPAT9基因的肝癌细胞及阴性对照细胞，接种于96孔细胞培养板，接种密度为 每孔1000个细胞，培养7天。每天取细胞进行细胞生长活力(MTT)测定，每天测3个复孔，连续 测定7天后，根据MTT吸光度值画出生长曲线。敲降AGPAT9肝癌细胞生长显著减慢，结果见图 5〇
[0027] 从图5可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞增殖速度变慢。*P〈 0.05，**P〈0.01。
[0028]流式细胞仪检测细胞周期： 收集细胞，生理盐水洗涤两遍，75 %酒精-20°C固定过夜。每组三个重复。PBS洗涤两遍 固定过的细胞，200ml PBS重悬，加入RNA酶Α 20μ1于37°C消化30min。用400目筛网过滤，将 细胞转入流式细胞仪上样管中，加入400ml PI溶液，混匀后4°C避光孵育30min。流式细胞仪 检测细胞DNA含量，分析细胞周期。独立性实验重复3次，并计算细胞周期百分率平均值（图 6)〇
[0029] 从图6可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的G1期细胞比例增 加，G2/M期细胞比例减少显著下调，提示细胞周期阻滞。
[0030] 平板克隆形成实验： 将敲降AGPAT9的肝癌细胞以及空载体阴性对照细胞，接种于6孔细胞培养板，接种密度 为每孔500个细胞，一个细胞做3个复孔，培养约10天，直至细胞克隆直径大于1mm WBS洗两 次后，75 %乙醇固定细胞，用0.5 %结晶紫染色。用水洗掉多余的结晶紫后，晾干，直接对每 孔细胞计数。敲降AGPAT9肝癌细胞克隆形成能力显著减弱，结果见图7。
[0031] 从图7可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受SiRNA抑制后，细胞的克隆形成能力降 低。
[0032]细胞体外侵袭实验 采用BD公司的Transwell体外浸润模型，在BD公司培养小室上层底部接种200μ1细胞 (含人工基质Matrigel胶），下层加入2ml完全培养基，每组三个复孔，37°C5%C02培养48h。 取出小室，用棉签轻轻擦净小室内的细胞，95 %酒精固定30min，3 %结晶紫染色30min，洗净 后于光学显微镜下观察。于20倍目镜下固定取上下左右边缘及中心五个视野计数穿膜细胞 数，取各视野的平均数表示肿瘤细胞的侵袭能力（图8)。
[0033]从图8可以看出，肝癌细胞中AGPAT9表达受siRNA抑制后，细胞的侵袭能力降低。 [0034]裸鼠皮下成瘤实验 待AGPAT9稳定敲降的MHCC-97H细胞及其空载体对照细胞生长至70~80 %汇合时，消化 细胞，制成单细胞悬液;取4-6周龄的Balb/c裸鼠，在其腋背交界皮下接种细胞，细胞接种 3X106/个，每种细胞接种6只裸鼠；待肿瘤形成后每三天测量一次肿瘤大小，绘制肿瘤生长 曲线（图9) ;4-6周后处死、解剖裸鼠，取出肿瘤组织，10%福尔马林固定包埋制成石蜡组织 切片观察病理形态。
[0035] 从图9可以看出，肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞注射于裸鼠皮 下，形成的移殖瘤数目和大小显著减少。
[0036]裸鼠肿瘤转移实验： AGPAT9稳定敲降的MHCC-97H细胞及其空载体对照细胞制成1106/ml的单细胞悬液，取 l〇〇ul注射到5周龄的雄性裸鼠尾静脉，每组10只小鼠，注射8周后处死、解剖小鼠，取出肺组 织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，在多个切面制作切片，HE染色，镜下计数转移性结节，计 算不同组细胞的肺转移结节形成平均数(图10)。
[0037] 从图10可以看出，肝癌细胞MHCC-97H稳定敲降AGPAT9表达后，细胞经尾静脉注射 后，在裸鼠体内的转移能力降低。
[0038] 发明人的研究发现，肝癌组织中AGPAT9基因发生高频率的DNA扩增，mRNA和蛋白表 达均显著上升。本发明公开了一种原发性肝细胞癌诊断试剂盒及其制备方法与应用，该试 剂盒可以快速、准确地进行AGPAT9的检测，从而可以对原发性肝细胞癌做出快速的辅助诊 断，具有重要的临床应用价值。本发明包括采用荧光定量PCR方法检测AGPAT9基因 DNA拷贝 数和mRNA表达量，采用免疫组化方法检测AGPAT9蛋白表达量。基于AGPAT9基因 DNA拷贝数或 AGPAT9蛋白表达量的检测试剂盒操作简单、试剂稳定、重复性好、特异性强、敏感性高、操作 简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
[0039] 联合诊断： 长期以来，AFP(甲胎蛋白）作为原发性肝癌的诊断指标，为临床做出了重大的贡献。但 是，AFP的敏感性是有限的；特别是近年来，AFP阴性的肝癌患者有上升趋势，因此，寻找AFP 之外的肿瘤早期标志物是当务之急。由于肝细胞癌具有较高的异质性，同时检测2种或以上 的肿瘤生物标记物被认为是肿瘤早期诊断的较好选择。发明人的研究发现，在426例肝癌患 者中，有161例为血清AFP阴性，然而，其中有83例（51.6%，83/161)为六6?六了9高表达。这一结 果提示发明人，在AFP阴性肝癌患者中，AGPAT9也许是一个较好的检测指标。AGPAT9与经典 标志物AFP两者联合检测原发性肝细胞癌，可大大提高肝癌的早期诊断率，弥补单纯检测 AFP的不足。
[0040] AGPAT9蛋白表达与肝癌患者的术后转移率，总生存风险和无疾病生存风险密切相 关。Cox回归分析证实AGPAT9蛋白表达是肝癌患者的独立预后因素。因此，基于AGPAT9蛋白 表达该试剂盒还可用于肝癌患者的预后评估和监测肿瘤转移。
[0041 ]靶向AGPAT9基因的siRNA可抑制肝癌细胞的体内外致瘤和转移能力，抑制AGPAT9 酶活性的抑制剂可通过抑制其产物磷脂酸的产生抑制其促癌作用，为开发肝癌新的靶向治 疗药物提供了理论依据。
【主权项】
1. 抑制AGPAT9基因表达或翻译的试剂在制备治疗肝癌药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制AGPAT9基因表达或翻译的试剂为 AGPAT9基因启动子抑制剂、AGPAT9基因的siRNA。3. 在体内使AGPAT9蛋白活性降低或失活的试剂在制备治疗肝癌药物中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:在体内使AGPAT9蛋白活性降低或失活的试 剂选自AGPAT9蛋白抗体、AGPAT9酶活性抑制剂。5. 定量AGPAT9基因 DNA扩增量或表达量的试剂作为肝癌诊断或预后评估试剂的应用。6. 定量AGPAT9蛋白DNA扩增量或表达量的试剂作为肝癌诊断或预后评估试剂的应用。7. -种肝癌诊断或预后评估试剂，该试剂同时含有定量AGPAT9基因或蛋白表达量的试 剂与AFP的试剂。
【专利摘要】本发明公开了AGPAT9基因在制备治疗肝癌药物、诊断及预后评估试剂中的应用。发明人的体内外实验结果证实AGPAT9在肝癌中起着促癌促转移的作用。因此，可以合成或制作此基因的抑制物，作为肝癌潜在的靶向治疗药物；由于该基因在肝癌中有DNA扩增和mRNA及蛋白表达升高，故可制作检测该基因DNA变异和表达变化的试剂盒以用于诊断肝癌；由于该基因表达的降低与病人预后密切相关，故检测其表达水平变化的试剂盒也可用于其预后的评估，以指导临床的治疗。
【IPC分类】A61K48/00, A61K31/713, A61P35/00, A61K45/00, A61K39/395, C12Q1/68
【公开号】CN105582536
【申请号】CN201511033481
【发明人】王辉云, 买世娟, 王梦鹤, 袁林静, 李品东
【申请人】王辉云
【公开日】2016年5月18日
【申请日】2015年12月30日