一种治疗肝癌的增效纳米药物组合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，涉及一种治疗肝癌的增效纳米药物组合物及其制备方法。更具体地讲，本发明通过采用生物技术手段干预细胞自噬或调控氧化压力，增强对肝癌细胞的杀伤效果；该组合物可作为肝癌治疗药物的辅料或添加剂。
【背景技术】
[0002]据报道,肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma)是目前世界上第六大流行性癌症，统计显示，每年约有50万人被诊断为肝细胞性肝癌(Forner A, Llovet JM, BruixJ.Hepatocellular carcinoma.Lancet.2012;379:1245-55.do1:10.1016/S0140-6736(11)61347-0S0140-6736 (11) 61347-0)。尽管包括手术治疗、化疗和放射性治疗在内的多种治疗手段已广泛应用于肝细胞性肝癌的治疗，但由于肝细胞系肝癌复发和转移的高发生率以及低生存率，导致肝细胞性肝癌成为世界范围内癌症相关死亡的第三大原因(Li F，GuoZj Wang H.1nfluencing elements and treatment strategies associated with therelapse of hepatocellular carcinoma after surgery.Hepatogastroenterology.2013;60:1148-55.do1:10.5754/hgel21124)。因此，开发有效的治疗药物与方法迫在眉睫。
[0003]研究显示，纳米技术广泛应用于增强药物和基因等多种治疗制剂有效递送。纳米颗粒装备靶向肝脏组织上过表达的受体，可实现药物的肝脏靶向治疗(Mishra N，YadavNP，Rai VKj Sinha P,Yadav KSj Jain S，et al.Efficient hepatic delivery ofdrugs:novel strategies and their significance.B1med Res Int.2013;2013:382184.do1:10.1155/2013/382184;Duan F，Lam MG.Delivery approaches of gene therapy inhepatocellular carcinoma.Anticancer Res.2013;33:4711-8.do1:33/11/4711)。 树枝状大分子具有乙二胺内核和重复的酰胺-胺分枝，具备良好的装载DNA和蛋白质的能力，是目前药物递送材料中最具发展前景的载体(Xu Qj Wang CHj Pack DW.Polymericcarriers for gene delivery: chitosan and poly (amidoamine)dendrimers.CurrPharm Des.2010; 16:2350-68.do 1: BSP/CPD/E-Pub/000132)。已有研究证实表皮生长因子与树枝状大分子形成的偶联物可有效地实现基因向肝癌细胞的靶向递送(YuH，Nie Y，Dohmen C，Li Y, Wagner E.Epidermal growth factor—PEG funct1nalizedPAMAM-pentaethylenehexamine dendron for targeted gene delivery produced byclick chemistry.B1macromolecules.2011;12:2039-47.do1:10.1021/bml01464n)。
[0004]细胞自噬(autophagy)是原核和真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程，负责讲解细胞内长寿蛋白及损伤的细胞器等，是维持细胞内环境稳定的重要手段(Levine B, Kroemer G.Autophagy in the pathogenesis of disease.Cell2008; 132:27-42.) 0细胞自噬的主要特征是双层膜结构的形成，其发生与mTORCl的抑制，自噬相关蛋白(Atgs)的表达及相关信号通路的激活密切相关(Corradetti MN, GuanKL.Upstream of the mammalian target of rapamycin:do all roads pass throughmT0R?0ncogene2006;25:6347-6360.He C，Kl1nsky DJ.Regulat1n mechanisms andsignaling pathways of autophagy.Annu Rev Genet 2009;43:67-93.)。细胞自嗷(autophagy)又叫II型程序性死亡(type II programmed cell death)，是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradat1n)的现象，能分解细胞内受损或多余的细胞器和蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。近年来随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切。根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自卩遼可分为三种方式:大自曬(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侣介导的自卩遼(chaperone-mediated autophagy, CMA)。主要概述的大自卩遼(以下简称自曬)与肿瘤发展及治疗关系最为密切(Sridhar S, Botbol Y, Macian F, et al.Autophagyand disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012;226(2):255-73.)。自噬是胞浆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。该过程大致能分为4个阶段:1.在饥饿、缺氧、药物干扰等某些因素的刺激下，自噬泡的双层膜结构开始逐渐形成并包围在被降解物的周围；2.自噬泡完全成型并将要被降解的物质完全隔离于细胞质；3.自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体；4.自噬溶酶体最终被溶酶体中的水解酶溶解，降解产物可以在细胞内再循环利用。(Martinez-Borra J, Lopez-LarreaC.Autophagy and self-defense.Adv Exp Med B1l.2012; 738:169-84.)。自卩遼能对细胞对外部环境改变及各种刺激产生应激反应。细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，称基础自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调。如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基酸等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活(①Piacentini M, D’ElettoM，Falasca L，et al.Transglutaminase2at the crossroads between cell death andsurvival.Adv Enzymol Relat Areas Mol B1l.2011;78:197-246 ;② Cook KL, ShajahanAN, Clarke R.Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.Expert RevAnticancer Ther.2011; 11 (8): 1283-94.；(3) Wirawan E, Vanden Berghe T，Lippens S，etal.Autophagy: for better or for worse.Cell Res.2012; 22(1):43-61.) 0
[0005]自噬能降解折叠错误的蛋白质、损伤的细胞器等，延缓机体衰老的发生。研究表明，大量衰老性疾病，如神经退行性疾病和恶性肿瘤都与细胞自噬密切相关(① Martinez-Borra J,Lopez-Larrea C.Autophagy and self-defense.Adv Exp MedB1l.2012;738:169-84.;② Caballero B，Coto-Montes A.An insight into the roleof autophagy in cell responses in the aging and neurodegenerative brain.Histol Histopathol.2012;27(3):263-75.；③ Mendelsohn AR, Larrick JW.Rapamycinas an antiaging therapeutic?: targeting mammalian target of rapamycin totreat Hutchinson—Gilford progeria andneurodegenerative diseases.Rejuvenat1nRes.2011:14(4):437-41.)。
[0006]细胞自噬在生物体的发育和分化过程中起了重要作用。据报道，自噬基因缺失或者突变的线虫生长发育缺陷、衰老加速并缩短寿命；并且自噬也参与果蝇变态的发生。此外自嗷在哺乳动物成年个体组织器官发育和分化中也起了重要作用(Mizushima N, KomatsuM.Autophagy:renovat1n of cells and tissues.Cell.2011;147 (4):728-41.)。
[0007]此外作为程序性细胞死亡的一种，细胞自噬能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡。(Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell death by autophagy:facts and apparentartefacts.Cell Death Differ.2012;19(1):87-95.)。
[0008]细胞在一些特定的条件下，由于一系列因素的影响导致了各类基因突变从而导致的细胞各类遗传性状及功能改变。这类改变可能将具有正常功能和特性的细胞转变为具有分裂迅速、抗凋亡等恶性特征的细胞即癌细胞。研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。
[0009]一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，一些已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自曬缺乏可引起自曬底物p62积聚，通过NF-k B信号途径引起肿瘤形成(TrocoliA, Djavaher1-Mergny M.The complex interplay between autophagy and NF-k Bsignaling pathways in cancer cells.Am J Cancer Res.2011; 1 (5):629-49.)。然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。研究表明，在缺乏血清或氨基酸的情况下约3h，HeLa细胞中的自噬部分从4%上升到37%。这也说明了在营养缺乏等条件下自卩遼也是肿瘤细胞的一种自我保护的机制(Baldwin AS.Regulat1n of celldeath and autophagy by IKK and NF-