k B:critical mechanisms in immune funct1nand cancer.1mmunol Rev.2012;246(1):327-45.)。
[0010]越来越多的证据表明，细胞自噬影响很多关键的细胞过程，如程序性细胞死亡、细胞增殖、炎症反应和固有免疫功能等，因此，细胞自噬可能在纳米递药材料应用于肿瘤治疗中起决定性作用。研究发现富勒烯能够在细胞内产生R0S并诱导细胞自噬，可促进化疗药物阿霉素和顺钼杀伤肿瘤细胞的能力(Zhang Q, Yang ff, Man N, Zheng F, Shen Y, Sun K, LiY, et al.Autophagy-mediated chemosensitizat1n in cancer cells by fullereneC60nanocrystal.Autophagy2009; 5:1107-1117.);此外,基因运输载体阳离子脂质体，纳米胶束等纳米递药材料均能诱导细胞自曬，其具体机制仍有待进一步研究(Man N, ChenY, Zheng F,Zhou ff, Wen LP.1nduct1n of genuine autophagy by cat1nic lipids inmammalian cells.Autophagy2010;6:449-454.Halamoda Kenzaoui B, Chapuis BernasconiC, Guney-Ayra S, Juillerat-Jeanneret L.1nduct1n of oxidative stress, lysosomeactivat1n and autophagy by nanoparticles in human brain-derived endothelialcells.B1chem J2012;441:813-821.)。
[0011]发明简述:
[0012]本发明的目的是提供一种治疗肝癌的增效纳米药物组合物及其制备方法。具体包括通过采用生物技术手段干预细胞自噬或调控氧化压力，增强对肝癌细胞的杀伤效果；该组合物可作为肝癌治疗药物的辅料或添加剂。
[0013]本发明所述的自噬干预手段包括但不限于自噬干预药物(化合物/多肽)、自噬相关基因、自噬相关信号通路蛋白阻断剂与纳米材料组合而成的复合物。
[0014]更具体的，本发明的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，由一种或多种纳米材料与细胞自噬干预药物组成。本发明优选的实施例中，该药物组合物还包括活性氧抑制剂。
[0015]本发明中，所述纳米材料为纳米递药材料，选自树枝状大分子(PAMAMDendrimers)，聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA)，碳纳米管或聚乙烯亚胺(PEI )。
[0016]本发明中，所述的细胞自噬干预药物选自3-甲基腺嘌呤、氯喹、羟基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴伐洛霉素A1，或自噬相关基因的siRNA，shRNA。
[0017]本发明中，所述的活性氧抑制剂是N-乙酰半胱氨酸。
[0018]本发明中，采用药物与纳米材料之间进行离子相互作用，或通过化学键形成反应，或物理结合，或生物反应制成纳米药物组合物。
[0019]本发明的治疗肝癌的增效纳米药物组合物中，纳米材料与细胞自噬干预药物序贯使用。在本发明的实施例中，优选两种细胞自噬干预药物3-甲基腺嘌呤、氯喹与纳米递药材料如树枝状大分子形成复合物或序贯使用的方法；细胞自噬抑制药物与纳米递药材料序贯使用可明显增强对肝癌细胞的生长抑制和细胞凋亡。
[0020]在本发明的实施例中，还优选采用活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸，结果显示能明显增强对肝癌细胞的生长抑制和细胞凋亡，抑制活性氧可增强细胞自噬抑制药物与纳米递药材料引起的肝癌细胞的生长抑制和细胞凋亡。
[0021]本发明中，纳米药物组合物以下述任一组中的形式进行配方:固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。
[0022]本发明采用生物技术手段制备的纳米药物组合物，通过采用生物技术手段干预细胞自噬或调控氧化压力，通过自噬干预手段与纳米递药材料联合作用，增强对肝癌细胞的杀伤效果；该组合物可作为肝癌治疗药物的辅料或添加剂。
【附图说明】
[0023]图1显示了树枝状大分子可引起人肝癌细胞HepG2细胞自噬体的形成。
[0024]图2显示了树枝状大分子可引起人肝癌细胞HepG2细胞自噬荧光形成。
[0025]图3显示了树枝状大分子可引起人肝癌细胞IfepG2LC3-1I表达量增加。
[0026]图4显示了抑制细胞自噬增强树枝状大分子对人肝癌细胞HepG2的生长抑制。
[0027]图5显示抑制细胞自噬增强树枝状大分子对人肝癌细胞IfepG2的细胞凋亡。
[0028]图6显示了抑制细胞自噬增强树枝状大分子引起的人肝癌细胞HepG2PARP的剪切。
[0029]图7显示了抑制活性氧增强树枝状大分子引起的人肝癌细胞H印G2的生长抑制和细胞凋亡。
[0030]图8显示了抑制活性氧增强树枝状大分子与细胞自噬抑制药物对人肝癌细胞HepG2的生长抑制。
【具体实施方式】
[0031]以下结合附图并通过具体实施例进一步说明但不限定本发明。
[0032]实施例1、树枝状大分子诱导人肝癌细胞HepG2发生细胞自噬
[0033]人肝癌细胞IfepG2用100 u g/ml的树枝状大分子处理24h后，进行石蜡包埋、切片、染色，在透射电子显微镜下观察细胞亚显微结构，结果如图1所示，给药组细胞内有大量的典型的双层膜结构自噬体，而对照组则未发现；
[0034]人肝癌细胞H印G2用100 u g/ml的树枝状大分子处理24h后，采用Cyto_ID细胞自噬检测荧光染料进行染色，在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图2所示，给药组细胞和雷帕霉素作用组细胞可观察到明显的绿色荧光，而对照组绿色荧光强度很弱；
[0035]人肝癌IfepG2细胞用100 u g/ml的树枝状大分子处理不同时间后，将离心收集到的细胞用PBS洗1次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20 y g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和0 -actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。IfepG2细胞经过树枝状大分子处理不同时间或不同浓度处理后，通过WesternBlot的检测，实验结果如图3所示，与对照组相比，给予树枝状大分子细胞的LC3 II的表达水平增强。
[0036]实施例2、抑制细胞自噬增强树枝状大分子对人肝癌细胞IfepG2的生长抑制
[0037]人肝癌细胞HepG2 用 PAMAMdendriemrs (12.5 u g/ml-100 u g/ml)处理 24 小时，给药前3h加入细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤或氯喹处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力，实验结果如图4所示，3-甲基腺嘌呤或氯喹预处理可明显增强树枝状大分子引起的人肝癌细胞H印G2的生长抑制。
[0038]实施例3、抑制细胞自噬增强树枝状大分子对人肝癌细胞IfepG2的细胞凋亡
[0039]人肝癌细胞HepG2 用 PAMAM dendriemrs (12.5 u g/ml-100 u g/ml)处理 24 小时，给药前3h加入细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤或氯喹处理细胞，24h后采用Annexin V/PI测定各组的细胞凋亡程度。实验结果如图5所示，3-甲基腺嘌呤或氯喹预处理可明显增强树枝状大分子引起的人肝癌细胞H印G2的细胞凋亡。将离心收集到的细胞用PBS洗1次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道20y g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和PARP抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用ECL显色液显色。实验结果如图6所示，3-甲基腺嘌呤或氯喹预处理可明显增强树枝状大分子引起的人肝癌细胞HepG2PARP的剪切。
[0040]实施例4、抑制活性氧增强树枝状大分子对人肝癌细胞的生长抑制和细胞凋亡
[0041]人肝癌细胞HepG2 用不同浓度的 PAMAM dendriemrs (12.5 u g/ml-100 u g/ml)处理24小时，给药前3h加入NAC处理细胞，24h后采用MTT法测定各组的细胞活力，实验结果如图7所示，NAC预处理可明显增强树枝状大分子引起的肝癌细胞的生长抑制。
[0042]实施例5、抑制活性氧增强树枝状大分子与细胞自噬抑制药物对人肝癌细胞的生长抑制
[0043]人肝癌细胞HepG2 用不同浓度的 PAMAM dendriemrs (12.5 u g/ml-100 u g/ml)处理24小时，给药前3h加入3-甲基腺嘌呤或氯喹处理细胞，随后加入N-乙酰半胱氨酸处理24h后采用MTT法测定各组的细胞活力，实验结果如图8所示，NAC预处理可明显增强树枝状大分子与细胞自噬抑制药物引起的肝癌细胞的生长抑制。
【主权项】
1.一种治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，该药物组合物由一种或多种纳米材料与细胞自曬干预药物组成。2.按权利要求1所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，该药物组合物还包括活性氧抑制剂。3.按权利要求1所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，所述纳米递药材料选自树枝状大分子(PAMAM Dendrimers),聚乳酸聚乙二醇酸共聚物(PLGA),碳纳米管或聚乙烯亚胺(PEI)。4.按权利要求1所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，所述的细胞自噬干预药物选自3-甲基腺嘌呤、氯喹、羟基氯喹、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴伐洛霉素Al，或自噬相关基因的siRNA，shRNA。5.按权利要求2所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，所述的活性氧抑制剂是N-乙酰半胱氨酸。6.权利要求1所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，其包括:采用药物与纳米材料之间进行离子相互作用，或通过化学键形成反应，或物理结合，或生物反应制成纳米药物组合物，所述的药物为细胞自噬干预药物。7.按权利要求1所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，所述的纳米材料与细胞自噬干预药物序贯使用。8.按权利要求1或2所述的治疗肝癌的增效纳米药物组合物，其特征在于，以下述任一组中的形式进行配方:固体、溶液、分散剂、胶束、乳剂、脂质体或纳米微球。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，涉及一种治疗肝癌的增效纳米药物组合物及其制备方法，本发明通过采用生物技术手段干预细胞自噬或调控氧化压力，增强对肝癌细胞的杀伤效果；所述的增效纳米药物组合物，由一种或多种纳米材料与细胞自噬干预药物组成，该药物组合物还包括活性氧抑制剂。本发明的药物组合物中，纳米材料与细胞自噬干预药物序贯使用，明显增强对肝癌细胞的生长抑制和细胞凋亡，经采用活性氧抑制剂结果显示能增强细胞自噬抑制药物与纳米递药材料引起的肝癌细胞的生长抑制和细胞凋亡。所述的药物组合物可作为肝癌治疗药物的辅料或添加剂。
【IPC分类】A61K48/00, A61K45/00, A61K47/04, A61K9/14, A61K47/34, A61P35/00, A61K47/32
【公开号】CN104971350
【申请号】CN201410133596
【发明人】鞠佃文, 李玉彬, 曾贤, 钱晓璐, 王绍飞, 王子玉, 范佳君, 孙筠, 宋平, 冯美卿
【申请人】复旦大学
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月3日