肿瘤干细胞分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞的分 子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞和正 常细胞中检测不到。
【背景技术】
[0002] 肿瘤干细胞被认为是癌症复发、转移的主要原因，癌症治疗中以肿瘤干细胞为靶 标的重要性已被指出。但是肿瘤组织中肿瘤干细胞比率较低（非专利文献4)，特异性识别 肿瘤干细胞并进行治疗是极其困难的。肿瘤干细胞的检测技术以及以肿瘤干细胞为靶标的 新疗法的开发已成为癌症医疗中的重要课题。
[0003]目前，作为已知的肿瘤干细胞标记，有⑶133、⑶24、⑶44等分子标记（非专利文献 1~7)，据说仅在极少数癌细胞中具有有效性，为了在更多种类的癌症中检测肿瘤干细胞， 需要鉴定新的分子标记。
[0004] 现有技术文献
[0005]非专利文献 I :Shu Zhang et al.，Cancer Res. 68:(11)4311-4320, 2008
[0006]非专利文献 2：Sh i h-Hwa Chiou et al. , Clin. Cancer Res. 14(13)4085-4095, 2008
[0007]非专利文献 3 :Gang-Ming Zou, J. Cell. Physiol. 217 :598-604, 2008
[0008]非专利文献 4 :Cheong J. Lee et al., J Clin Oncol 26 :2806-2812,2008
[0009]非专利文献 5 :Madhuri Kakarala et al. , J Clin Oncol 26 :2813-2820, 2008
[0010]非专利文献 6 :Craig D. Peacock et al., J Clin Oncol 26 :2883-2889,2008
[0011]非专利文献 7 :Xing Fan et al. , J Clin Oncol 26 :2821-2827, 2008
【发明内容】
[0012] 发明要解决的问题
[0013] 本发明的目的在于，提供在肿瘤干细胞的检测中有用的分子标记。
[0014] 解决问题的手段
[0015] 为解决上述课题，本发明人等在持续进行深入研究时着眼于如下新的见解，所述 新见解为：对于肿瘤干细胞标记基因而言必不可少的是，在至少1种组织中有用性更高且 优选在多个组织中的来源于该组织的正常细胞中看不到表达、在肿瘤干细胞中能看到表 达，即在鉴定肿瘤干细胞基因时的待测物中通常含有正常组织的情况下在该待测物中的正 常组织中几乎不表达。并且判明：迄今为止所报告的针对肿瘤干细胞的标记基因在正常组 织中几乎都高水平表达，而本发明人等在进一步研究中发现，已知的转录因子基因-性别 决定Y区域转录因子2(Sex determinig Region Y-box2，Sox2)基因虽然在成人正常细胞中 看不到表达，但意外的是其在肿瘤干细胞中表达。并且，进一步研究时发现，以精子线粒体 相关富含半胱酸蛋白（Sperm Mitochondria-associated Cysteine-rich Protein, Smcp) 基因为首的其它基因也是在成人正常细胞中几乎不表达而在肿瘤干细胞中表达，从而完成 了本发明。
[0016] 即，本发明涉及分子标记，其为用于检测作为检测对象的细胞团中的肿瘤干细胞 的分子标记，其在该检测对象所含的肿瘤干细胞中能检测到，但在非肿瘤干细胞的癌细胞 和正常细胞中检测不到。
[0017]此外，本发明涉及前述分子标记，检测对象为来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、 骨骼肌、肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末 梢血单核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织的细胞团。
[0018]进而，本发明涉及前述分子标记，其在本发明全部检测对象的非肿瘤干细胞的癌 细胞和正常细胞中检测不到。
[0019]进而，本发明还涉及前述分子标记，该分子标记为选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、 Intsl、Koxl2、Mdn、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表 达产物。
[0020] 此外，本发明涉及以前述分子标记为指标来判定判定对象中是否存在肿瘤干细胞 的方法。
[0021] 进而，本发明涉及前述方法，细胞团含有正常细胞和/或非肿瘤干细胞的癌细胞。
[0022] 进而，本发明涉及前述方法，细胞团来源于选自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、 肾脏、胰脏、脾脏、胸腺、前列腺、精巢、卵巢、小肠、白细胞、结肠、胃、骨髓、大肠和末梢血单 核细胞所组成的组中的1种或2种以上细胞或组织。
[0023] 此外，本发明涉及前述方法，判定是指：在检测到选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、 Intsl、Koxl2、Mdn、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所组成的组中的I种或2种以上基因的表 达产物的情况下，判定为存在肿瘤干细胞。
[0024] 此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为mRNA和/或内源性多肽。
[0025] 此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为mRNA，该方法包括利用RT - PCR法 检测的步骤。
[0026]此外，本发明涉及前述方法，基因的表达产物为内源性多肽，该方法包括利用与该 内源性多肽特异性反应的试剂检测的步骤。
[0027]此外，本发明涉及前述方法，试剂为抗体。
[0028] 此外，本发明涉及前述方法，判定在体外或体内进行。
[0029]此外，本发明涉及癌症治疗药的筛选方法，其包括下述步骤：
[0030] i)测定前述分子标记的、对细胞团投与候补化合物前的检测量A的步骤，
[0031] ii)对细胞团投与候补化合物的步骤，
[0032] iii)测定i)中所测定的分子标记的、对细胞团投与候补化合物后的检测量B的步 骤，和
[0033] iv)比较A和B，在A显著大于B的情况下，将候补化合物判定为候补癌症治疗药 的步骤。
[0034] 进而，本发明涉及用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，其含有用于检测前述 分子标记的试剂。
[0035] 此外，本发明涉及前述试剂盒，用于检测的试剂为用于检测mRNA的、具有与下述 基因互补的碱基序列的探针和/或引物，所述mRNA为选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、 Intsl、Koxl2、Mdn、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、 Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所组成的组中的I种或2种以上基因的表 达产物。
[0036] 此外，本发明涉及用于判定肿瘤干细胞是否存在的试剂盒，用于检测的试剂为 用于检测多肽的抗体，所述多肽为选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、 FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所组成的组中的I种或2种以上基因的表达产物。
[0037] 本发明还涉及癌症的判定方法，其使用前述试剂盒。
[0038] 本发明还涉及多肽，所述多肽为能够用作用于抑制肿瘤干细胞的功能或杀灭肿 瘤干细胞的抗原的多肽，所述多肽为由0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、 FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所编码的多肽或其一部分，或者在该多肽或其一部分中缺失、置 换或添加1个或多个氨基酸而形成的多肽。
[0039] 本发明还涉及抗体，该抗体与源于选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、Smcp、Intsl、Koxl2、 Mdfl、FU13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、Raslllb、Hes6、Znf415、 Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt和Scgb3al所组成的组中的1种或2种以上基因的表达产物的表位 特异性反应。
[0040] 此外，本发明涉及药物组合物，其含有至少一种以上的前述多肽和/或前述抗体。
[0041] 本发明还涉及前述药物组合物，药物组合物为癌症治疗用或癌症预防用组合物。
[0042] 本发明还涉及将前述多肽作为抗原抑制肿瘤干细胞的功能、或杀灭肿瘤干细胞的 方法。
[0043] 此外，本发明涉及前述方法，所述方法使用前述抗体。
[0044] 本发明还涉及编码前述多肽的核酸。
[0045] 本发明还涉及含有前述核酸的药物组合物。
[0046] 此外，本发明涉及前述药物组合物，所述药物组合物为DNA或RNA疫苗用药物组合 物。
[0047] 本发明还涉及通过主要组织适合抗原进行抗原呈递的肽的筛选方法，所述方法包 括下述步骤：
[0048]i)制备将目标多肽切断而成的具有适当长度的肽片段的步骤，
[0049]ii)将i)中获得的肽片段、抗原呈递细胞、和用目标多肽和/或i)中获得的肽片 段致敏的T细胞一起培养的步骤，
[0050] iii)测定ii)中获得的T细胞的活化程度的步骤，
[0051] iv)筛选iii)中使T细胞活化的肽片段的步骤，
[0052] 其中，目标多肽为前述多肽。
[0053] 本发明还涉及核酸，该核酸用于抑制肿瘤干细胞中选自0r7cl、Dnajb8、Sox2、 Smcp、Intsl、Koxl2、Mdfl、FLJ13464、667J232、Surf6、Pcdhl9、Dchs2、Pcdh21、Gal3stl、 Raslllb、Hes6、Znf415、Nkx2 - 5、Pamci、Pnmt 和 Scgb3al 所组成的组中的基因的表达。
[0054] 此外，本发明涉及前述核酸，该核酸为DNA和/或RNA。
[0055] 此外，本发明涉及药物组合物，其含有至少1种以上前述核酸。
[0056] 此外，本发明涉及药物组合物，该药物组合物为癌症治疗用组合物。
[0057] 此外，本发明涉及使用前述核酸抑制肿瘤干细胞的功能的方法。
[0058] 发明效果
[0059] 本发明提供的分子标记能够判别癌细胞所含的肿瘤干细胞、和非肿瘤干细胞的癌 细胞。并且前述判别能够通过检测单一分子标记来进行，因此能够极其简便地判别肿瘤干 细胞。
[0060] 此外，本发明的分子标记能够在肺癌细胞、乳腺癌细胞、大肠癌细胞等、多种肿瘤 干细胞中通用，作为具有通用性的肿瘤干细胞的分子标记是极其有效的。
[0061] 进而，本发明的分子标记在正常细胞中完全检测不到或者几乎检测不到，因此在 肿瘤干细胞的判别、以及含有肿瘤干细胞的肿瘤组织的判别中也是有用的。
[0062] 此外，本发明的分子标记与成瘤性的相关性高，在以它们为靶标的肿瘤干细胞的 免疫疗法、分子靶标治疗法、基因导入治疗法以及能够用于癌症治疗的药剂、肽等的筛选中 也是有用的。
【附图说明】
[0063]图1是表示肺癌细胞系中SP解析结果的图。用线包围的部分为各自的SP级分，％ 表示SP级分细胞相对于全部细胞的比例。
[0064] 图2是表示在N0D/SCID小鼠中肿瘤形成能力实验的结果的图。a)为移植后第8 周的小鼠的照片。b)为移植了 LHK2(肺癌细胞）的全部小鼠的肿瘤直径平均值土标准偏 差、肿瘤存活的小鼠数/移植的全部小鼠数的表。c)为将分别移植了 1500个LHK2(肺癌细 胞）、MCF7 (乳腺癌细胞）、SW480 (大肠癌细胞）的组每周肿瘤大小的平均值图表化的图。 [0065]图3:图3的a)为表示人成人正常细胞中Sox2的表达的图，b)为表示癌细胞细胞 系的SP级分和MP级分中Sox2的表达的图。
[0066] 图4:图4的a)为表示人成人正常细胞中Smcp和FLJ13464的表达的图，b)为表 示癌细胞细胞系的SP级分和MP级分中Smcp和FLJ13464的表达的图。
[0067] 图5为表不调查的基因在各细胞中的表达的一览表的图。图中，看不到表达者表 示为阴性，能看到表达者表示为阳性、能看到极微量表达但尚不能称之为显著表达的微量 表达表示为假阳性。另外，假阳性判定为"检测不到"。此外，图中LHK2为肺癌、MFH03为 软组织肉瘤、MCF7为乳腺癌、LHK2 - S0X2为过度表达S0X2基因的LHK2细胞系、SW480和 KM12为大肠癌细胞系。
[0068] 图6是表示其它癌细胞系中Sox2的表达的图。
[0069] 图7是表不其它癌细胞系中Smcp的表达的图。表不的是将PCR循环分别设定为 35个循环和40个循环进行调查的结果。图中Caki - 1、ACHN、SMKTR - 1~4为肾细胞癌 的细胞系，Sq - 1为肺癌扁平上皮癌的细胞系，1 一 87、A549、LHK2为肺癌腺癌的细胞系， LC817为肺癌小细胞癌症的细胞系，86 - 2、Lu99为肺癌大细胞癌症的细胞系，HPC3为胰脏 癌症的细胞系，LCC(Mouse)为小鼠肺癌细胞。
[0070]图8:图8a)为表示正常细胞和癌细胞系SW480、KM12、LHK2、MCF7的SP级分和MP 级分中Intsl的表达的图；b)为表示癌细胞系中Intsl的表达的图。图中癌细胞系与图6 和图7中相同。
[0071] 图9是表示肺癌组织中免疫组织染色的结果的图。情形1和情形2分别为来自不 同癌症患者的肺扁平上皮癌组织的染色像。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核， 茶色部分为通过抗S0X2抗体染色后的S0X2抗原蛋白。
[0072] 图10是表示乳腺癌组织中免疫组织染色的结果的图。情形1为细胞质图案，情形 2为核图案的染色像，CK5为用抗CK5抗体染色的染色像，S0X2为用抗S0X2抗体染色的染 色像。蓝色部分表示通过苏木精染色而被染色的核，茶色部分为通过抗CK5抗体或抗S0X2 抗