与猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及动物分子育种领域，尤其设及一种基于KISS-1基因的与猪繁殖性状相 关的分子标记及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，利用与育种性 状相关的各种标记代替W表型为基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实 现对基因型的直接选择，可克服直接选择的弊端，提高选择的准确性和缩短世代间隔。
[0003] 总产仔数、产活仔数等猪的繁殖性状是重要的经济性状，直接关系到养猪业的经 济效益。
[0004] KISS-1基因是Lee JH等于1996年利用消减杂交的方法研究人黑瘤素细胞不同转 移能力时发现并命名，具有抑制肿瘤转移作用。人KISS-1基因被定位于lq32-41，包含4个外 显子和3个内含子，前2个外显子不翻译。KISS-1基因的编码产物为kissp邱tin,是G蛋白偶 联受体54(G protein-coupled receptor 54,GPR54)的配体，并组成KISS-1/GPR54系统。越 来越多的研究表明，KI S S -1 / G P R 5 4系统在哺乳动物初情期的启动中起关键作用， kissp邱tin对下丘脑-垂体-性腺轴具有重要调控作用。目前，尚未见KISS-1基因与猪繁殖 性能关联分析的报道。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种与猪繁殖性状相关的 分子标记，为猪的分子育种提供新的思路，本发明的另一个目的是提供所述分子标记的检 测方法和应用。
[0006] 技术方案:本发明所述的与猪繁殖性状相关的分子标记，它为猪KISS-1基因片段， 所述的猪KISS-1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS-1基因核巧酸序 列中的第2343位，所述的多态性位点具有G/C碱基的变异。
[0007] 猪KISS-1基因序列的核巧酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的多态性位点，与猪总 产仔数、产活仔数紧密相关，可利用该位点开发与猪繁殖性状相关的分子标记。本发明中， 描述多态性位点的位置时，W基因的转录起始点核巧酸位置为Ibp，上游为负，下游为正J员 次记数，第2343bp位是指KISS-1基因的转录起始点开始的第2343bp位，该位点处于SEQ ID NO. 4所示序列的第2643bp位。
[000引本发明所述的猪KISS-1基因片段如SEQ ID N0.1所示。当然，本发明所述的猪 KISS-1基因片段也可W为包含如SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列的DNA片段。根据检测方 法，可W选择合适长度的能够包含多态性位点的DNA片段。
[0009] 本发明还提供了所述分子标记的检测方法，包括：
[0010] (1)根据所述的分子标记的核巧酸序列设计引物；
[0011] (2) W待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增；
[001 ^ (3)判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。
[0013] 步骤(3)中，可对PCR产物进行测序或电泳分析，判断多态性位点的碱基类型。
[0014] 优选的，步骤(1)中，上游引物的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的核巧 酸序列如SEQ ID NO.3所示。利用该引物，可采用PCR-RFLP的方法准确方便的检测多态性位 点的类型。
[0015] 本发明还提供了所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。
[0016] 具体的，猪可W为小梅山猪、枫径猪或大白猪。繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018] 本发明研究发现，猪KISS-1基因第2外显子存在一个突变位点（即多态性位点），该 位点位于猪KISS-1基因核巧酸序列中的第2343位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产 仔数或产活仔数相关，且容易检测，从而本发明根据该突变位点提供了一种与猪繁殖性状 相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分 子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中PCR-RFLP检测结果；
[0020] 图2为实施例1中PP和QQ基因型个体PCR产物测序结果；
[0021] 图3为实施例1中PP和QQ基因型个体的氨基酸比对结果；
[0022] 图4为实施例1猪KISS-1基因 G2343C酶切位点分析结果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。
[0024] 实施例1
[0025] 2013年采集106头小梅山猪、42头枫径猪和70头大白猪的耳样；同时整理了江苏农 林职业技术学院小梅山猪育种中屯、2004年~2012年期间上述106头小梅山母猪的生产档 案，共有698窝仔猪记录，主要收集产仔年份、胎次、TNB、NBA等指标。耳样(约0.15g)用耳号 错采集，-20°C冻存。用常规的酪氯仿抽提法提取猪基因组DNA，对基因组DNA进行0D值测定， 计算其浓度，并用d地2〇稀释至终浓度为10化g/化，原液-20°C保存，稀释液4°C保存，稀释液 作为PCR扩增的模板。
[00%] 第一步:根据GenBank公布的猪KISS-1基因全序列(登录号:NC_010451.2)，确定猪 KISS-1基因第2外显子区域。
[0027]第二步：采用PrimerS.O软件设计1对引物，扩增第2外显子区域。引物为：KISS- 2.1。上游弓|物序列为：5'-1：(31：(3(31:1邑。邑曰(31:1:1邑1：(3(31：-3'，下游弓|物序列为：5'- tctcccgctgcactaacac-3'，扩增区域为2262bp-249化p(SEQ ID N0.1)，扩增产物长度 23f5bp。
[002引第Ξ步:PCR-RFLP检测。
[0029] PCR扩增。PCR扩增反应体系为20化，包括：10XBuffer2.0μL，25mMMg2+2.2化， lOmM dNTPs 0.如L，10yM上、下游引物各化L，DNA模板化L(lOOng)，抓?化-iTaq酶0.2化， d地2〇 11.如UPCR扩增反应程序：94°C预变性5min;31个循环（94°C变性lmin，59°C退火 30s，72°C延伸Imin);最后72°C延伸10min，4°C保存产物。
[0030] RFLP检测程序:反应体系为10化，包括化L PCR产物、0.2化内切酶(Mstl)、l化10 X Buffer和6.如L d地2〇。酶切溫度水浴过夜，R化P产物用10 %的聚丙締酷胺凝胶120~ 200V电泳3~地，银染，拍照保存。基因型分型结果见图1，图1中，泳道1、2、4的基因型为QQ， 泳道3、5、10、13的基因型为PP，泳道6-9、11、12的基因型为PQ，Μ为Marker。
[0031] 第四步:将PP和QQ基因型个体的PCR扩增产物送上海生工生物公司进行测序，测序 结果见图2。氨基酸比对结果显示:G2343C导致谷氨酸(Glu)变为谷氨酷胺(Gln)，即E55Q，见 图3。酶切位点分析发现，G2343C产生一个新的酶切位点，即MstI，见图4。
[0032] 第五步:分析该位点在不同猪群中的分布情况。结果见表1，3个猪群中共检测到3 种基因型与2个等位基因，小梅山猪与枫径猪中等位基因 P为优势基因，基因频率分别为 0.684、0.845;大白猪中未能检测到PP型个体，QQ型为优势基因型，占总数的92.86%。
[0033] 表1 3个猪群KISS-1基因 G2343C位点的基因型频率与等位基因型频率
[0034]
[0035] 第六步:SPSS软件关联分析该突变位点与繁殖性状间的关系。结果见表2,1~2胎 小梅山母猪中，PQ型个体的TNB为11.65头、比PP型个体高0.42头(P〉0.05)，比QQ型个体高 0.65头(P〉0.05);PQ型个体的NBA为11.10头，比PP、QQ型个体分别高0.45头(P〉0.05)、0.39 头(P〉0.05)d2胎W上小梅山母猪中，PQ型个体的TNB为12.58头、比？?型个体高0.16头。〉 0.05)，比QQ型个体高2.70头(P<0.01); PQ型个体的NBA为11.93头，比PP、QQ型个体分别高 0.38头(P〉0.05)、2.58头(P<0.01)。所有胎次的小梅山母猪中，PQ型个体的TNB为12.34头、 比PP型个体高0.19头(P〉0.05)，比QQ型个体高2.13头(P<0.01); PQ型个体的NBA为11.72头， ttPP、QQ 型个体分别高 0.37 头(P<0.05)、1.97 头(P<0.01)。
[0036] 表2 KISS-1基因 G2343C位点与小梅山猪繁殖性状的关联分析
[0037]
[003引注:N为窝数;TNB为总产仔数;NBA为产活仔数
[0039] 结果提示:猪KISS-1基因 G2343C位点杂合子繁殖性能优于纯合子，在选种时应加 强杂合子的选留。
【主权项】
1. 一种与猪繁殖性状相关的分子标记，其特征在于，它为猪Kiss-1基因片段，所述的猪 KISS-1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS-1基因核苷酸序列中的第 2343位，所述的多态性位点具有G/C碱基的变异。2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的猪KISS-1基因片段包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。3. 根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，所述的猪KISS-1基因片段如SEQ ID NO. 1所示。4. 一种根据权利要求1~3任一项所述的与猪繁殖性状相关的分子标记的检测方法，其 特征在于，包括： (1) 根据权利要求1~3任一项所述的分子标记的核苷酸序列设计引物； (2) 以待检测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增； (3) 判断PCR扩增产物中多态性位点的类型。5. 根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，上游引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.2所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。6. -种根据权利要求1~3任一项所述的分子标记在猪繁殖性状选择中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，猪为小梅山猪、楓泾猪或大白猪。8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，繁殖性状为总产仔数或产活仔数。
【专利摘要】本发明公开一种与猪繁殖性状相关的分子标记及其检测方法和应用。所述分子标记为猪KISS-1基因片段，所述的猪KISS-1基因片段含有多态性位点，所述的多态性位点位于猪KISS-1基因核苷酸序列中的第2343位，所述的多态性位点具有G/C碱基的变异。本发明发现猪KISS-1基因第2外显子存在一个突变位点，该位点位于猪KISS-1基因核苷酸序列中的第2343位，该突变位点与猪的繁殖性状尤其是总产仔数或产活仔数相关，且容易检测，本发明根据该突变位点提供了一种与猪繁殖性状相关的分子标记，并提供了该分子标记的检测方法及在猪繁殖性状选择中的应用，为猪分子育种、研究猪繁殖生理机制提供基础。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105671172
【申请号】CN201610143591
【发明人】吴井生, 陈永霞, 郭苹, 陈超
【申请人】江苏农林职业技术学院
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月14日